動脈硬化と微小血管症に基づく心血管疾患（CVD）は.糖尿病の主要な合併症であり.糖尿病における身体障害と死亡の主要原因である。 内皮細胞（ECs）の損傷と機能障害は.糖尿病性血管合併症の発症と進行のイニシエーションファクターである。 そのため.内皮の損傷メカニズムを解明し.損傷した内皮の構造や機能を修復する有効な方法を見つけることが.研究のホットトピックとなっているのです。
内皮前駆細胞（EPC）は骨髄由来の細胞で.in vitroで増殖し.さらにECに分化することができ.損傷した内皮の修復や再灌流に関与しています。 内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）は.EPCの遊走能に必須である。
酸化ストレスは.体内のグルコース濃度が高くなると引き起こされ.その結果.EPCの機能低下や一酸化窒素（NO）の産生低下が起こりますが.スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）の介入により.NO分泌の増加や機能回復につながる可能性があります。 抗酸化酵素には.スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）.カタラーゼ（CAT）.グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）があり.非酵素的抗酸化系にはビタミンC.ビタミンE.グルタチオン.メラトニン.アルファリポ酸（ALA）.カロテノイド.銅.亜鉛.セレン（Se）などの微量元素が含まれます。
本研究では.EPCを高濃度グルコースとインキュベートして酸化ストレスを誘発し.培養上清中のマロンジアルデヒド（MDA）と一酸化窒素（NO）の濃度を測定した。 GPx-1とeNOSのmRNA発現はリアルタイム蛍光定量RTPCRにより.タンパク質発現はウェスタンブロットにより観察し.その後抗酸化物質ALAを適用して そして.抗酸化物質であるALAを介在させ.グルコースによるEPCの障害メカニズムと治療法を検討し.糖尿病性血管合併症の予防と治療の基礎とすることを目指した。
1.材料と方法
1.1 材料
1.1.1 実験動物：クリーングレードの健康なオスWistarラット15匹（体重180-200g）.河北医科大学実験動物センターから提供.動物証明書番号902035。
1.1.2 試薬 MDA・NO測定キット（南京建成生物工学研究所）.50％ブドウ糖注射液（華瑞製薬株式会社）.EGM-2MV培地（LONZA.米国）.ラットリンパ球分離株（天津宝陽有限公司）。
ヒトフィブロネクチン（Solabank Technology Co, Ltd）.トリプシン（Sigma.米国）.RNA 抽出試薬 Trizol Reagent（Invitrogen.米国）.逆転写酵素（M-MLV ）.ランダムプライマーはすべて Promega 製.ウサギ抗ヒトポリクローナル GPx-1 抗体（ABCAM.英国）.ウサギ抗ヒトポリクローナル GPx-1 抗体（ABCAM, 米国）.ウサギ抗ヒトポリカル GPx-2 抗体（ABCAM, 米国）.ウサギ抗ヒトポリカル GPx-2 抗体（ABCAM, 米国）。 eNOS抗体（Santa, USA）.ALA（Eisai Pharmaceutical Co.）
1.1.3 実験器具 紫外線分光光度計（756MC）（上海精密器械科学有限公司）。
)，ABI 7300 real-time fluorescence quantitative PCR system (PE, USA), UVP gel scanning system (UVP, USA), DYZ22A double constant-time electrophoresis instrument and DYY-III bridge electrophoresis instrument (Beijing Liuyi Instrument Factory), 倒立顕微鏡 (Olympus, Japan), ultra-clean table (HFsafe1200) (Likang Development Co, Ltd), carbon dioxide. (CVD),（日本）。 インキュベーター（MCO-15AC）（Heraeus, Germany）.細胞培養プレートおよび培養ビン（Corning, USA)
1.2 実験方法
1.2.1 ラット骨髄EPCの培養
ラットの下肢を外科用ハサミで切除し.下肢の皮膚を切り落とし.下肢を75％アルコールに30分間浸し.超清浄台で膝関節に沿って大腿骨と脛骨を分離し.下肢の筋肉を除去し.下肢の骨を無菌状態で露出させてPBS入り培養皿に浸して両端を切り落とし.骨髄腔をPBSで繰り返し超清浄台で洗い清めた。
その後.この洗浄液をラットリンパ球分離片にゆっくりと重ね合わせ.2000rpmで20分間遠心分離した後.チューブ内の液を3層に分け.中央の白濁層を吸引し.4倍量のPBSを加えて混合し.上清を捨てて10分間遠心分離し.この洗浄を1度繰り返しました。 最後の遠心分離後.上清を捨て.EGM-2MVを加えて細胞を再懸濁させる。
Fnを5ug/cm2でウェルプレートに散布し.細胞懸濁液を2×106cells/mLの密度で6ウェルプレートおよび24ウェルプレートに接種した。 48時間後に最初の全量を交換し.その後は毎日.7日以降は隔日で液交換を行った。 細胞の成長は.倒立顕微鏡で毎日観察した。
1.2.2 2EPCの同定
形態学的同定：毎日.倒立顕微鏡で細胞の形態と成長を観察する。
DIL-Ac-LDLとFITC-Lectin-UEA-1の併用によるEPCの取り込み：培養10日目の細胞をDIL-Ac-LDL（2.5ug/mL）を含む培地に加え.4時間インキュベート.PBSで3回洗浄した後.2％パラフォルムアルデヒドで20分固定し.FITC-Lectin-UEA-1を加えた( 10ug/mL）.1時間インキュベートし.レーザー共焦点顕微鏡で観察し.オレンジ-黄色に二重染色された細胞がEPCであり.二重染色された細胞を数えた。
1.2.3 実験グループ分け
EPCを0.25%トリプシン/0.02%EDTAで4日間消化し.24時間グループ分けを行った。
EPCをノーマルコントロール（NC）としてグルコース5 mmol/L.ハイグルコース（HS）としてグルコース30 mmol/L.ALAグループとしてグルコース（30 mmol/l）＋αリポ酸（40μg/l）で48時間インキュベートした。
1.2.4 NOとMDAは化学比色法.GPx-1とeNOSのEPCでの発現はウェスタンブロット法.GPx-1 mRNAのEPCでの発現はリアルタイム蛍光定量RT-PCR法により測定した。
1.3 統計手法
すべてのデータは.SPSS 13.0統計解析パッケージを使用して解析された。 すべての測定データは平均値±標準偏差( ±s)で表した。 複数サンプルの平均値は.完全無作為化計画による一元配置分散分析を用いて比較し.P<0.05で有意差とした。
2.実績
2.1 EPCによるMDA分泌に対する様々な介入の効果（表3）
培養上清の MDA レベルは.高グルコース介入 48 時間後に正常対照群より高くなった（P<0.05）。ALA 投与後は高グルコース群と比較して MDA レベルが減少した（P<0.05）。
2.2 EPCのGPx-1およびeNOS発現に対する異なる介入の効果（図1-4.表1）
EPCのGPx-1およびeNOSの発現は高グルコース介入48時間後にコントロール群に比べ有意に低下したが.ALA介入後は高グルコース群に比べ有意に増加した（いずれもP<0.05）。
2.3 EPCのGPx-1およびeNOS mRNA発現に対する異なる介入の効果（図5-8.表2）。
EPCのGPx-1およびeNOS mRNAの発現量は.高グルコース介入48時間後にコントロール群に比べて有意に低下したが.ALA介入後にEPCのGPx-1およびeNOS mRNAの発現量は高グルコース群に比べて有意に増加した（いずれもP＜0.05）。
2.4 EPCの分泌NOレベルに対する様々な介入の効果（図9.表3）
高糖度介入48時間後のEPCは正常対照群に比べNOの分泌量が少なかったが（P < 0.05）.ALA介入後のEPCのeNOS発現量は高糖度群に比べ有意に増加し（P < 0.05）.培養上清のNO濃度が増加した。
3.ディスカッション
2004年.米国糖尿病学会（ADA）の年次総会で.Banting賞を受賞したBrownleeが講演した。大血管合併症も微小血管合併症も.同じ病態.すなわち高血糖障害の共通の基盤である酸化ストレスによって引き起こされる.と。同年.欧州糖尿病学会（EASD）年次総会で最優秀賞を受賞したセリエロは.インスリン抵抗性.糖尿病.心血管疾患の共通メカニズムとしての酸化ストレス-共通土壌説-について講演を行った。
EPCは.循環する末梢血中に存在し.骨髄.臍帯血または胎児肝臓に由来する血管内皮細胞（ECs）に分化できる前駆細胞である。 血管傷害や組織虚血の場合.骨髄に存在するEPCは局所的に放出される成長因子やサイトカインに反応して増殖し.成熟内皮細胞に分化して末梢循環に移動し.傷害や虚血部位に特異的に巣を作ってさらに増殖し成熟内皮細胞に分化して血管新生と再内皮化に関与することが可能である。
EPCの数や機能が低下すると.内皮の損傷と修復のバランスが崩れ.内皮の完全性が損なわれ.粥腫病変が発生します。 したがって.内皮前駆細胞は.アポトーシスと再生のバランスを調整し.内皮層の健全性を維持する上で重要な役割を担っているのです。 したがって.EPCの機能は.糖尿病性血管合併症の発症・進展と密接に関係しており.心血管疾患の予測因子であると言えます。
Dernbachら[6]は.健康成体EPCの酸化感受性を調べ.健康成体EPCは臍帯静脈内皮細胞に比べて細胞内ROSレベルが低く.酸化剤によるアポトーシスも少ないこと.EPCの表面では臍帯静脈内皮細胞に比べてマンガンスーパーオキシドディスムターゼ（MnSOD）やGSH-Px.CATといった抗酸化物質の発現量が増えていることから.健康成体であること EPCは内皮細胞よりも強い抗酸化力を有しています。
これにより.その生存能力が促進されるが.リスクファクターがEPCの内因性抗酸化システムに及ぼす影響を打ち消すには十分ではなく.高度の酸化ストレス下でEPC内の酸化還元状態のバランスが崩れ.アポトーシスや老化が起こり.その機能が損なわれてしまうのだ。
血糖値の上昇は.PKC経路を通じて細胞内のNADPHを活性化し.大量の活性酸素を発生させて細胞を傷つけ.正常な細胞の生理活性の低下.エネルギー代謝や細胞シグナル伝達などの機能の障害を引き起こすため.高血糖によって酸化ストレスが誘発される可能性があることを意味している。 また.高グルコースは.酸化ストレスやP38MAPK経路を介して.EPCの骨髄動員や生存に影響を与えることが明らかになっています。
糖尿病患者やグルコース処理したEPCは.NOのバイオアベイラビリティの低下やeNOSの補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（BH4）の減少により.eNOSのカップリングが解除されてスーパーオキシドのマイナスイオン（O-）が発生し活性酸素種（ROS）クラスターの蓄積につながり.さらにEPC数および移動能が減少しました。 oxLDLを介した細胞内の酸化ストレスは.動脈硬化の病態に重要な役割を果たすと言われています。
OxLDLは.EPCのeNOSを阻害することで老化を促進し.EPCの機能に影響を与える。 最近の研究では.糖尿病患者のox-LDLは.抗酸化作用や抗炎症作用により血管機能の保護因子と考えられているHDLとは対照的に.P53を介したシグナル経路を通じてEPCの機能不全を引き起こすことが示されている。
今回.ラット骨髄由来EPCを高グルコースと48時間インキュベートしたところ.培養上清中のMDA濃度が有意に上昇したことから.高グルコースはEPCの酸化ストレスにつながることが示唆されました。 これにより.アポトーシスや酸化的DNA損傷が引き起こされる可能性があります。
GPx-1は.酸化ストレスから内皮を保護し.その結果.安定した血管環境を維持するのに重要な役割を果たすレドックスタンパク質である。 研究により.単離された頸動脈のプラークでは.GPx-1活性が低下していることが示されている。 また.高濃度のシステインを添加して培養した内皮細胞では.GPx-1の過剰発現により血管内皮機能が正常に維持されることが明らかにされています。
さらに.GPx-1の欠損は.血管内皮機能障害だけでなく.心臓や血管の構造異常が存在することも明らかにされている。 また.GPx-1ノックアウトマウスから分離したAc-LDL+ Lectin+ VEGFR-2+ eNOS+細胞は.in vivoおよびin vitroにおいて.血管新生の促進が機能的に欠損しており.酸化ストレスに対する感受性が高まっている [21]． 抗酸化酵素の働きを阻害する一方で.生体内ではEPCの老化と機能不全を引き起こし.さらにアポトーシスを増加させる。
eNOSはチトクロームP450還元酵素に似た酵素で.電子供与体NADPHからサブチリシン補酵素へのフラビンによる電子伝達を触媒する。eNOS補酵素BH4はサブチリシン基に近く.Lアルギニンのグアニジニウム窒素に電子伝達してNOを生成できる。 LアルギニンまたはBH4がない場合.eNOSはO2-およびH2O2という現象を生成し.このことは.「eNOSは.O2を生産している。 この現象はeNOSのアンカップリングと呼ばれる。
eNOSはEPCの動員や機能制御に重要な役割を果たす。eNOSのカップリングが解除されると活性酸素レベルが上昇し.EPCの機能が損なわれる。 糖尿病患者においては.eNOSのアンカプリングによりEPCの数が減少し.その機能が低下し.最終的に血管疾患の発症につながることが知られています。
eNOSはEPCの遊走能を確保するために重要な物質であることが示されている。eNOSノックアウトマウスはEPCの遊走能の低下をもたらし[25].eNOSの十分な発現.NOの正常分泌.正常な生物活性の確保はEPCの生物機能を正常に保つための重要な因子である。 本研究では.高濃度のグルコースを48時間EPCに介在させ.その結果.EPCの EPCのGPx-1タンパク質発現量およびmRNA発現量は減少し.eNOSタンパク質発現量mRNA発現量およびダウンレギュレーション.NO分泌量は減少していた。
したがって.本研究の結果は.高グルコースは.抗酸化酵素の発現を低下させることに加えて.EPCに酸化ストレスを与え.その結果.抗酸化能を損ない.その機能に影響を与えることを示唆するものであった。
ALAは天然の抗酸化物質であり.生理的および病理的過程で生成される様々なフリーラジカルを消去し.体内の酸化ストレスを軽減することが可能です。 ALA は.NO 活性の増加.活性酸素産生の減少 [26].NF-κB の発現抑制によりラットの血管内皮機能を改善し.内皮細胞における AMPK 経路の活性化.高グルコース誘発ミトコンドリア膜過分極の回復により生体内の酸化ストレスレベルを低減できることが研究により示されてい る。
本研究では.高グルコースでインキュベートした EPC に ALA を介入させることで.EPC において GPx-1 と eNOS の発現が上昇し.NO 分泌が増加し.MDA 分 泌が減少することが明らかになりました。これは.ALA 処理により高グルコースによって誘発された EPC の酸化ストレスを軽減し.抗酸化能を回復させてその機能を保護できることを示していると思われ ます。
結論として.高グルコース濃度は.一方ではEPCに酸化ストレスを誘発し.他方ではその抗酸化酵素の産生・発現を低下させて抗酸化能を損なわせるが.抗酸化ストレス処理によりEPCの抗酸化能とNO分泌能が改善されることがわかった。 このことから.抗酸化ストレスの治療は.糖尿病性血管合併症の発生・進展の予防・治療に意義があると考えられます。