幹細胞プールは.骨髄.皮膚.腸粘膜上皮など.絶えず更新される体内の組織に存在し.幹細胞の絶え間ない増殖と分化によって成熟細胞が生成される。 肝臓では.成熟した肝細胞がまだ分裂・増殖する能力を持っているため.肝組織における幹細胞の存在は長い間論争の的となっていた。 近年.発生生物学.特に幹細胞生物学の急速な進展に伴い.肝幹細胞の存在とその肝疾患発症における意義が注目されている。 肝臓のさまざまな病態は.幹細胞の異常増殖や分化と密接に関係している可能性があり.肝幹細胞の詳細な研究は.肝細胞癌だけでなく.さまざまな急性および慢性肝疾患の治療に魅力的な可能性を示しています。 肝臓幹細胞の理解と.この特殊な幹細胞をめぐる関連研究は.現代の幹細胞生物学と臨床医学のホットスポットの一つになっている。済南軍区総合病院 消化器科 張志剛
1 肝幹細胞の概念
1.1 発生期の肝幹細胞 ヒトの胚発生初期には.前腸末端の肝臓憩室が肝臓と尾部に進化し.そのうち肝臓は極めて急速に成長し.胚発生5週目には腹腔内の大部分を埋め尽くすようになる[1]。 この肝臓を進化させる胚性肝細胞は肝芽と呼ばれ.強い増殖能を持つだけでなく.肝細胞や胆管細胞への分化能を持つため[2].肝芽は実は胚性肝幹細胞なのです。 胚の発生過程で前腸末端のみが肝細胞に誘導される。肝細胞の特定の分化遺伝子の発現に重要な役割を果たす転写因子は.（i）同じ構造ドメインを持つ種々の肝細胞核因子1（HNF1）.（ii）一連の肝細胞核因子3タンパク質（HNF3）.（iii）核受容体スーパーファミリーの4ファミリーである。 (iv)ロイシンジップファミリー（C/EBP）。 標的細胞は.上記の転写因子によって制御され.特定の遺伝子の発現によって表現型の変化をもたらす。
胚性肝幹細胞の細胞マーカーには.アルブミン（ALB）.α-フェトプロテイン（AFP）.一連のサイトケラチン（CK7.8.9.14.18.19.20）などの分化マーカー.Thy1.Flt3.SCF/ckit.OV6などの関連幹細胞因子および受容体.CD34などの骨髄由来幹細胞マーカーがある（表1参照）。 3] は.上記の細胞マーカーに基づき.フローサイトメトリーソーティング（FACS）を用いて胚性肝幹細胞の分離・培養に成功し.分離した胚性肝幹細胞を同種動物の肝臓に移植すると.肝細胞や胆管上皮細胞に分化できることから.胚性肝幹細胞が多方向の分化能を有することを示しました。
1.2 成体肝幹細胞 正常な肝臓に幹細胞が存在するかどうかは.議論のあるところである。 成熟した肝細胞は.肝損傷後も中断することなく増殖能力を回復することから.肝臓そのものが「幹細胞プール」であることが示唆されている。 しかし.幹細胞の定義によると.幹細胞は分裂・増殖する能力に加えて.ある程度の分化能を持つことが望ましいとされています。 成熟肝細胞が分裂した子孫は成熟肝細胞のままなので.厳密な意味では成熟肝細胞は幹細胞とはみなされないはずである。
現在では.双方向の分化能を持つ上皮細胞は.組織学的にヘリング管に相当する胆道樹の末端領域に存在し.軟骨周囲に由来するサイズの小さい「何でもない」間葉系細胞である可能性があると考えられている。 重度の肝障害および/または成熟肝細胞の増殖障害がある場合.異常な活性化と増殖を示し.肝小葉の周辺部に多数出現し.組織学的には小葉の周囲に活発に増殖する小さな細胞集団として現れます。 これらの細胞は.核形質比が大きく.円形または卵形の核を持ち.肝楕円細胞（HOC）と呼ばれる。 増殖した卵円形細胞は.肝実質に沿って肝小葉の中心部に向かって移動し.そこで成熟肝細胞に分化して肝臓を修復・再建します。 同時に.卵円形細胞は胆管上皮細胞に分化し.肝内胆管の形成に関与することも可能である。 現在では.肝楕円体細胞が成体肝組織内の幹細胞であることが一般に認められています。 卵円形細胞が肝幹細胞であると考えられるもう一つの重要な証拠は.胚性肝幹細胞.すなわち成体肝細胞と同様の細胞マーカーを持ち.造血幹細胞といくつかの表面抗原を共有していることである（表1）。
成熟肝細胞の大量増殖の誘導には二つの前提条件がある。一つは.肝組織の再生を刺激する因子の存在で.ほとんどの肝切除や毒物（四塩化炭素など）が肝細胞の壊死を誘発する動物モデルでよく用いられる。もう一つは.正常肝細胞の増殖の阻害で.動物実験では成熟肝細胞の分裂阻害に用いられる薬剤は2acetylaminofluorene（以下.「2AF」という）である。 2アセチルアミノフルオレン（2AAF）.フモニシンB1（FB1）.レトロシンまたはコリン欠損エチオニン含有（CDE）飼料が成熟肝細胞の分裂阻害剤として動物実験で使用されてきた。
幹細胞は分化した細胞の機能を果たしているのではなく.増殖によって成熟した分化した細胞を作り出す機能を果たしている。 幹細胞分裂によって生み出された娘細胞は.親の特徴を維持して幹細胞のままか.あるいは末端分化に向かう特定の経路をたどるかの.どちらかの経路しか選べないのだ。 表1 成人肝細胞.卵円形細胞.肝細胞.胆管上皮細胞.肝細胞の細胞マーカー 注：＋：陽性.-：陰性.? 1.3 肝幹細胞の多能性と可塑性 近年.幹細胞の研究において.成人個体における多能性成体前駆細胞（MAPC）の発見が特に注目されている分野である。 肝幹細胞は肝臓そのものから得られるが.肝臓以外の幹細胞でも肝幹細胞や成熟肝細胞に分化できることが.ヒトや動物実験によって証明されている。 分離した骨髄多能性前駆細胞は.in vitro培養中に特定の増殖因子を添加することにより.表現型の異なる肝幹細胞や肝細胞の産生を誘導することができる[4]。 骨髄移植を受けた患者や動物モデルの肝組織に.ドナーの遺伝子マーカーを持つ肝細胞が存在することが.いくつかの研究により明らかにされている。 例えば.Dabeva (1997)は.ラットの膵臓組織から分離した上皮細胞が.近交系ラットの肝臓に移植した後.肝細胞にも分化し.肝小葉構造に統合されて.肝細胞特異的なタンパク質を発現できることを発見しました。 骨髄由来の前駆細胞がどのような能力で血流に乗って肝臓まで移動するのかは不明である。 骨髄の主な細胞成分は.造血幹細胞（HSC）.間葉系幹細胞（MSC）.内皮細胞前駆細胞であることが研究データから示唆されています。 現在のin vitroおよびin vivoの実験では.造血幹細胞（HSC）［5］と骨髄間葉系幹細胞（MSC）［6］の両方が肝細胞に分化することが実証されています。 肝臓の卵子がCD34.Thy1.Fly3.SCF/ckitといった骨髄幹細胞マーカーを持つという事実は.それが何らかの形で必ずしも造血幹細胞と結びついていることをまだ示唆してはいないのだ。 骨髄の多能性前駆細胞が.異なる微小環境下でトランス分化の能力を獲得したのか.あるいはそれ自体がよりプリミティブな多能性前駆細胞であるのかは不明である。
肝細胞の卵子はプラスチックです。 卵子は.消化管の上皮細胞や内分泌機能を持つ膵臓細胞に分化することができ[7].脳組織では.卵子は神経細胞やグリア細胞に分化し[8].心臓では.肝臓幹細胞が心筋細胞に分化することができます[9]。 村瀬 [11] は.致死量の放射線を照射したラットに肝臓だけを移植すると.骨髄造血が再確立し.骨髄移植と全く同じ救済効果が得られることを発見した。 肝移植を受けた患者において.その後移植された肝臓で見つかったB細胞リンパ腫はドナー由来（ドナーの遺伝子マーカーを持つ腫瘍細胞）であったと報告されています[12]。香港大学は.同様の患者の移植肝臓で見つかった間葉系肉腫もドナー由来であると報告しました[13]。 移植片対宿主病（GVHD）では.免疫学的に活性なドナー由来のリンパ球が多数.宿主にキメラ的に見出されることがある。 ドナー肝臓から異常に増殖したこれらのリンパ球や間葉系細胞の細胞起源は.第一に.ドナー肝臓を完全に灌流したにもかかわらず分離した後も一部の造血幹細胞が残っており.それらはドナー肝臓に残存する血液・造血幹細胞に由来すること.第二に.肝臓幹細胞が十分に可塑的であれば.ドナー肝臓中の多能性前駆細胞にも起源があると考えられることである。
2 肝幹細胞と肝疾患
2.1 肝幹細胞と急性肝損傷 肝損傷に対する再生反応は.非常に迅速かつ包括的に起こり（残存肝細胞はすべて増殖状態に入る）.精密な制御機構（様々な成長因子.サイトカイン.ホルモンの相乗効果）により制御されると同時に.通常の生理機能（解毒.胆汁分泌.グリコーゲン合成など）を発揮している。 急性肝障害による肝組織の再生は.主に残存する正常肝細胞の細胞周期への再突入によって達成されることが.動物実験や臨床研究によって明らかにされています。 理論的には.2/3肝切除したラットでは.残存肝細胞が平均3/2細胞周期で肝組織を再生し.1~2週間で全再生過程を完了することが可能です。 臨床現場における肝部分切除や急性肝炎による肝細胞の壊死は.動物モデルと同様の再生過程をたどる可能性がある。
成熟肝細胞の分裂・増殖が阻害されたり.肝細胞の壊死の程度が大きすぎると.肝再生は幹細胞の増殖を動員して行わなければならなくなる。 肝再生実験モデルでは.卵円形細胞がまず肝小葉の周囲で大量に増殖し.時間の経過とともに徐々に小葉の中に移動していくことが明確に観察されています。 臨床的にも.急性大量肝壊死の組織観察では.まず小葉の周囲の境界板の領域に楕円形の細胞が出現し.肝損傷4日目頃に楕円形の細胞が肝細胞に変化することが明らかにされている。
2.2 肝幹細胞と慢性ウイルス性肝炎 臨床の現場では.急性の肝組織の損傷や再生は実はあまり多くなく.慢性肝炎による肝細胞障害の再発や持続.この状態での肝細胞の代償性増殖が問題となることが多いのです。
肝細胞内では.HBVウイルスは自らの複製を完了し.あるいは肝細胞のゲノムと部位特異的に統合している。 同時に.ウイルス遺伝子は.肝細胞のタンパク質合成装置を使って.ウイルスに特異的なタンパク質を組み立てる。 ウイルスタンパク質は.肝細胞内で内因性抗原として処理された後.MHCI様分子と結合して肝細胞の表面に運ばれ.CTLによって特異的に認識されるか.Fas系によって死滅する。 ウイルスが有効な免疫機構によって体外に排出されれば.肝細胞の破壊はなくなり.代償的な再生が完了した後に回復する。 しかし.B型肝炎（あるいはC型肝炎）の特徴は.ウイルスクリアランスが困難で.肝細胞の障害と再生が再発・持続し.特に感染後期には成熟肝細胞が広範囲にウイルス感染し.ウイルス感染肝細胞がしばしば増殖能力を失い（組織化学的に.ウイルス抗原が陽性の細胞がPCNAで陽性染色されることはほとんどない）.幹細胞の増殖分化が代償増殖の主役となることである の細胞集団がある。 また.実験的研究により.肝炎肝硬変患者では.病理組織学的に過形成の病巣の周囲に幹細胞の増殖状態が見られることが確認されている[15]。
肝幹細胞は主に末端の胆管に存在し.慢性肝炎（特に活動性肝炎）の組織学的特徴の一つとして.合流部とその周囲の線維性結合組織間における大量の胆管増殖の存在が知られています。 慢性肝炎における肝線維化のメカニズムはまだ解明されていませんが.線維化の進展と肝幹細胞の増殖には明確な関係があるようで.患者の血清AFP高値は幹細胞の異常増殖とも関連している可能性があります。
2.3 肝幹細胞と原発性肝細胞癌 腫瘍学では.肝細胞癌が成熟肝細胞の分化（脱分化）から生じるのか.幹細胞の分化や脱分化の成熟停止（異分化）から生じるのか.現在議論がなされている。 異分化の見方が分かれる。
分化不全説は.発癌物質の作用対象が成熟した肝細胞であり.標的細胞の遺伝物質に変異や不安定化をもたらすとするものである。 この説を支持する実験的証拠としては.レトロウイルスを介した遺伝子導入による成熟肝細胞の標識化や.2acetylaminofluorene（2AAF）で誘導した肝細胞癌のモデルにおいて前癌病変が成熟肝細胞から発生しうることなどがあげられる。 ヒトの肝細胞癌では.成熟肝細胞の脱分化という仮説が一般的に受け入れられているようだ。 現在.ヒト肝細胞癌の分子生物学的研究は.腫瘍関連遺伝子のスクリーニングと.ウイルスゲノムの統合によって引き起こされると思われる肝細胞ゲノムの変異または不安定性を中心に展開されている。
分化阻害仮説は.発癌作用の標的が幹細胞が分化・成熟する微小環境であり.この微小環境の構造的および／または化学的メッセンジャー異常につながる様々な因子が発癌作用の主要因であり.腫瘍の本質は組織内にあらかじめ存在する幹細胞の分化阻害に由来すると考えるものである [16]． また.我々の研究では.慢性肝炎組織.肝硬変組織.傍癌性肝組織では.B型肝炎ウイルス蛋白産物が高レベルで発現することがあるが.癌性組織では.不思議とウイルス抗原の発現が消失し.ウイルス感染肝細胞はしばしば増殖活性を失い（PCNA陰性）.増殖した細胞は肝小葉周辺の小さな「楕円細胞」である場合が多いことが判明した 増殖している細胞は.肝小葉の周りにある小さな「楕円形の細胞」.つまり肝組織内の幹細胞であることが多い。
分化障害説を支持する他の証拠としては.肝悪性組織内に卵円形細胞が存在すること[17].肝細胞癌細胞と卵円形細胞は.AFP.GGP.サイトケラチン系列CK（7.8.18.19.20）.転写因子OC2およびOC3.卵円形細胞マーカーOV1およびOV6.幹細胞マーカーSCF／ckitおよびckit／ckit／ckit／ckit／ckit／ckit／ckit／ckit／ckit／ckit／okit／okit／okit／okit／okit CD34；肝細胞癌細胞もCD10やCD40などのB細胞分化抗原を発現していることが多くの研究で判明しているが.この抗原が卵子や成体肝細胞で発現しているかどうかは報告されていない；幹細胞と癌細胞の両方におけるテロメラーゼ活性；肝細胞癌細胞におけるウイルスの複製が少ないか.あるいは全くなく.ウイルス抗原の発現も少ないか全くない；肝細胞癌の多施設由来問題；肝細胞癌細胞株の試験管内での培養について 異質で双方向の分化特性を持つ 幹細胞の分化障害という仮説は複数の著者によって提唱されているが.肝がん細胞が生体内にあらかじめ存在する幹細胞に由来するという視覚的な証拠は.今のところ得られていない。
3 肝臓幹細胞応用の展望
肝幹細胞の研究はまだ黎明期であり.肝幹細胞の分離・培養・同定技術は未熟である。 肝幹細胞と慢性肝病理過程や肝癌との関係はさらに解明されておらず.成人肝幹細胞の多枝・多方向分化の制御機構はまだ明らかにされていない。
3.1 肝幹細胞と肝再建 様々な原因による急性および亜急性の肝細胞壊死は.肝の基本的な構造が保たれていれば.肝幹細胞の無限の増殖と肝細胞や胆管細胞への分化能を利用して.ヒト肝幹細胞移植により救命することが可能です。
ヒトの遺伝的欠陥のある肝疾患（肝腫大など）は.肝幹細胞を移植することで.肝移植と同等以上の治療ができる可能性があります。 10年前にRhimらは.遺伝子型が正常な成体マウスの肝細胞をアルブミンウロキナーゼ（AlbuPA）遺伝子導入マウスに移植すると.遺伝子導入マウスの肝機能障害を修正できることを報告し.AlbuPAフリー肝細胞が増殖し.最終的に遺伝子障害肝細胞に取って代わったことを示した。 翌年.同じ著者が.免疫寛容なAlbuPAトランスジェニックマウスにラット肝細胞を移植し.遺伝的に欠損したマウス肝細胞をラット肝細胞に100％置き換えることに成功したことを報告した。 一方.Overturfは.遺伝性チロシン病I型（HT1）変性肝疾患を発症するフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（FAH）遺伝子欠損マウスを動物モデルとし.正常な肝細胞を使用した 彼は.元の欠陥のある肝細胞をほぼ置き換えるために.わずか1000個の肝細胞が必要であることを発見し.肝細胞は造血幹細胞と同様の増殖能を有すると結論づけた。 しかし.分化した肝細胞は移植後の増殖能に限界があり.分化の方向性も単一であること.成熟した肝細胞は幹細胞よりはるかに大きく.門脈注入後に肝実質内に容易に分散しないことから.やはり幹細胞移植を優先すべきと一般的に考えられています。 臨床では.Kumarら[18]が原発性アミロイドーシスによる肝不全で.肝移植後も再発し.肝移植後10ヶ月と14ヶ月に幹細胞移植を行い治癒した例を報告しています。
3.2 肝幹細胞および肝細胞癌の治療 前述のように.肝細胞癌は肝幹細胞の分化が阻害された結果生じることがあり.肝の微小環境を改善して癌細胞を正常細胞に分化させたり.癌細胞のアポトーシスを誘導することによって治療することが可能である。 Coleman [19] は.10 年も前に.ラット肝幹細胞株 WBF344 から悪性化した同種肝細胞癌細胞株 GN6TF と GP7TB をホモラットの肝臓に移植したところ.GN6TF では腫瘍が発生せず.癌細胞が肝実質内に統合されて正常肝板を形成したことを報告している。一方 GP7TB は肝臓で腫瘍性を維持したものの.組織形態学的には腫瘍は十分分化していた . 結論は.肝組織の微小環境は.がん細胞の分化に影響を与え.腫瘍細胞の悪性度を排除または低下させることができるというものである。 肝細胞癌細胞株を試験管内で成熟肝細胞の表現型に分化誘導する実験がいくつか報告されているが.分化誘導の分子機構や臨床応用の展望については.まだ十分な検討がなされていないのが現状である。
3.3 肝幹細胞・遺伝子治療 遺伝子治療は.遺伝子に欠陥のある病気や悪性腫瘍に対しても.免疫拒絶反応を起こさず.患者が長期間の免疫抑制剤を服用する必要のない.最も有望な治療法である。 肝細胞への外来遺伝子の導入は.成熟した肝細胞の体外培養の限界を考えると難しく.幹細胞の利用は容易である。 遺伝子組換え肝幹細胞や骨髄幹細胞は.宿主の肝細胞が増殖する微小環境が良好であれば.肝臓の代謝不全を改善することが期待され.そのような遺伝子組換え幹細胞の自己移植は有望である。