近年.骨欠損の治療を目的とした骨組織工学技術の研究が盛んになるにつれ.組織工学的に作られた骨芽細胞.特に血管内皮前駆細胞に関する研究も盛んになってきました。 本稿では.血管内皮前駆細胞の起源.生物学的特性.血管新生を改善するメカニズム.骨修復における役割.治療.応用に関する研究の進展について概説する。
骨修復は.様々な細胞や細胞外マトリックスが関与し.様々な成長因子やホルモンによって制御される複雑な病態生理学的活動である。 近年.骨組織工学の技術は骨欠損修復の研究において注目されており.その研究の多くは種細胞の選択と培養に焦点が当てられている。 内皮前駆細胞（EPC）は1997年に浅原によって初めて報告され.従来の生後血管新生と血管障害修復の理論を更新し.虚血性疾患治療に新しい考え方を提供した。
1.EPCの起源
現在.EPCと造血幹細胞は.共通の幹細胞であるヘマンギオブラストに由来することが一般に受け入れられている。 EPCの定義や起源についてはまだ議論の余地がありますが.多くの研究から.EPCは主に臍帯静脈血.成人の末梢血.骨髄に由来し.末梢血のEPCは骨髄に.臍帯血のEPCは胎児肝臓に由来することが示唆されています。 正常な状態では.EPCの数は非常に少なく.末梢血で約2～3/mL.臍帯血で約3.5倍と言われています。 血管内皮増殖因子（VEGF）や線維芽細胞増殖因子（FGF）など.EPCの増殖に適した培養条件下で.大量に増殖・拡大することができるのです。 Asaharaら[1]は.EPCはCD34.CD133.VEGF.Fibroblast growth factor（FGF）.FGFなどのさまざな特徴を持つ細胞群であると報告した。 Asaharaら[1]は.EPCはCD34.CD133.VEGFR-2+などの表面マーカーが陽性で.in vitro培養後に血管内皮細胞へ増殖・分化できる.さまざな特性を持った前駆細胞群であると報告しています。 胚の血管新生に関与するだけでなく.臍帯血.末梢血.骨髄にも存在し.生後の血管新生時に強い血管新生促進作用を持ち.血管新生的に新生血管EPCを形成します。
2.EPCの生物学的特性
2.1 EPCの表面マーカー
EPCを同定するための特定の表面マーカーはないが.多くの学者はCD34+細胞は造血幹細胞と内皮前駆細胞の共通の前駆細胞であると信じている。前駆細胞（MAPC）はEPCの元となる細胞です。 VEGF.FGF.IGF-Ⅰに応答してCD34+.CD133+.VEGFR-2+.Flk1+の血管新生細胞に分化し.成熟した血管内皮細胞に分化し続けることができ.内皮細胞の重要な供給源となっています。
初期の研究では.EPCは造血幹細胞表面マーカーCD34と内皮細胞表面マーカー血管内皮増殖因子受容体-2（VEGFR-2）の両方を発現する細胞と定義されました。 その後.Peichevらは.CD133抗原は血管内皮前駆細胞のみに存在し.成熟内皮細胞はCD133を発現しないことを見出し.CD34+.VEGFR-2+.CD133+を発現する細胞を機能的血管内皮前駆細胞と呼ぶことにした。 Harrazらは.CD34-細胞が条件培養（CD34+細胞を培養した培養液）で徐々に内皮細胞に分化することを見出し.CD34+細胞はある未知の因子を分泌してCD34-細胞の内皮細胞への分化を促していると結論づけた。
Rehmanらは.骨髄MSCやCD34-CD14+単球もVEGFなどによる誘導後.in vitroで機能的な血管内皮細胞を形成することを報告している。 また.単核マクロファージから内皮細胞の分化が誘導されることも報告されている。
2.2 EPCの動員
骨髄における前駆細胞の移動は.局所的な環境によって決定される。 エラスターゼ.ヒストンG.マトリックスプロテアーゼファミリー（MMP）などのサイトカインの動員により.造血幹細胞インテグリンの作用で.幹細胞とストローマ細胞の接着結合を除去し.幹細胞が経内皮移動により最終的に骨髄を離れることを可能にし.両者の相互作用を妨げる。
生理的には.虚血は骨髄EPCの動員を誘導するシグナルになり得ると考えられている。 このように.虚血はVEGFをアップレギュレートして循環に放出し.MMP-9依存性で骨髄前駆細胞の動員を誘導することができるのです。 血液内科では.骨髄移植のために末梢血から造血幹細胞を採取するなどの骨髄幹細胞の動員を含む他の要因が確認されています。 また.エリスロポエチン（EPO）は赤血球の増殖と成熟を促進し.マウスやヒトでは末梢血中の内皮前駆細胞の数を増加させる作用があります。 虚血性心疾患患者の血清EPO値と骨髄中のCD34+またはCD133+幹細胞との関係は.EPCの動員に関する生理学的指標として内因性EPO値が重要な役割を果たすことを裏付けている。
しかし.どの動員因子がEPCを増やすのに最も重要であるかは不明である。 動物実験では.VEGF165は造血幹細胞や循環内皮前駆細胞を速やかに動員するのに対し.アンジオポエチン-1（ANG-1）は内皮細胞や造血前駆細胞の動員を遅らせる.弱い動員を誘導することが示された。 さらに.EPCのレベルを薬理学的に調節する最初の証拠は.動脈硬化予防薬のMG-CoA還元酵素阻害薬（スタチン）を用いた研究によってもたらされました。
スタチンは.マウスや安定した冠動脈疾患の患者さんにおいて.試験管内でEPCの数や機能活性を増加させることが研究により示されています。 スタチンは.骨髄中の幹細胞を増加させ.EPCの数を増やし.EPCの増殖.EPCの動員.EPCの老化やアポトーシスの防止などEPCの機能を向上させることができます。
2.3 EPCの分化
Koyanagiらは.共培養系においてEPC-心筋細胞接触面にカルモジュリンEおよびNが発現していること.カルモジュリンEを阻害するとEPCのトランスディフェクションが抑制されることを見出し.EPCのトランスディフェクションに細胞間相互作用が影響していることを示唆した。 同様に.心筋細胞へのトランス分化という概念も最近疑問視されている。Salesらは.in vitroで10-15日間TGF-β1によって誘導されたEPCが.ラミニン.フィブロネクチン.IおよびIII型コラーゲンを分泌しながら.内皮表現型（CD31+/vWF+/αSMA-）から間葉表現型（CD31+/αSMA＋）に変化できることを明らかにしたのだ。 しかし.EPCがMSCにトランス分化しており.EPCと混合している可能性のあるMSC前駆細胞や細胞融合によるものではないことを確認するために.さらなる研究が必要である。 EPCは成熟内皮細胞よりも高い平滑筋細胞マーカーを発現し.PDGF-BBによって異なる表現型（収縮性または合成）の平滑筋細胞への分化を誘導したことから.血管平滑筋細胞へも分化する可能性が示唆された。
これらの研究は.EPCの運命は必ずしも直線的ではなく.ある条件下では他の分化経路をたどる可能性があることを示唆している。つまり.異なる細胞が共有する「EPCs状態」は動的かつ不安定であり.外部環境要因の影響を受けて他の幹（前駆）細胞状態に変化し.次のように分化する可能性があるということだ。 EPCは動的で不安定なものです。
3.骨修復におけるEPCの役割
3.1 EPCが血管新生を改善するメカニズム
EPCの血管新生における役割は明らかにされていますが.EPCがどのように血管新生を促進するのかについては疑問が残ります。 組織損傷がない場合.前駆細胞の役割は弱いが.虚血組織では.遺伝子標識した骨髄由来細胞がECのマーカータンパク質を共発現し.その効果には大きなばらつき（0％から90％の範囲）がある。 同様に.脳卒中後の脳組織における骨髄由来細胞の役割は何でしょうか？ 文献上の報告はかなり異なっています。
2つの研究では.1つは骨髄由来の陽性細胞の平均34％が内皮マーカーを発現し.もう1つは内皮マーカーを発現する細胞を検出できず.主に腫瘍の血管新生モデルで多数（50％）が検出されました。 血管の近傍に骨髄由来の細胞のみを検出し.内皮マーカータンパク質を発現していない研究もある。 1つの可能性として.虚血モデル（例：傷害や虚血の程度）がこれらの細胞の役割に大きく影響することが挙げられます。 軽度の虚血では内皮前駆細胞はほとんど動員されないが.骨髄前駆細胞はごくわずかしか動員されない。 また.細胞移植の効果は.細胞のサブポピュレーション（例えば.純粋な造血幹細胞か骨髄細胞か）によっても異なる場合があります。 実際.精製骨髄単核細胞や膨張内皮前駆細胞の静脈内投与は.骨髄移植細胞の体内動員よりも良い結果をもたらすという。
Tie-2陽性の骨髄由来細胞は.自殺遺伝子を活性化することにより腫瘍の血管新生を阻害し.これらの細胞は腫瘍の血管系に統合されるが.血管系の近傍で検出されることができる。 このように.EPCは.サイトカインや成長因子を供給することで血管新生を促進するという点で.単球やマクロファージと同様の働きをすることができるのです。 研究により.異なる起源を持つ培養EPCは.VEGF.HGF.IGF-1などの成長因子を発現できることが示されています。 付着単球も同様の条件で培養でき.VEGF.HGF.G-CSFを放出するが.内皮マーカータンパク質を発現できない。EPCは新血管の構造に取り込むことができ.生体内で内皮マーカータンパク質の発現に関与していることが示唆される。一方.マクロファージは成長因子も放出できるが血管構造には組み込まれず.虚血後組織の新血管の増加をわずかに誘導するだけである。 上記の研究では.内皮マーカータンパク質の発現におけるEPCの役割を確認することはできなかった。
上記の研究では.EPCが生体内で血管様構造の形成に関与することは確認できなかったが.新生血管の状態を改善することは確認された。
3.2 骨修復におけるEPCの役割
EPCは.統合.融合.パラクリン分泌などのメカニズムにより.新生血管や内皮細胞の再生に関与し.組織工学において種細胞として働き.組織工学的骨の生体内血管形成を促進すると考えられている。 骨移植後の基本的なプロセスは.移植片の血管新生.骨再生.骨端の癒合の3つであり.このうち血管新生は.移植片の修復過程を通して作用し.骨再生と癒合の様式と効果を決定する重要な要素である。 組織工学的な骨をin vitroで構築した後.特に大量に構築した場合.骨芽細胞前駆細胞.関連因子.栄養素.その他骨修復に関与する細胞を局所微小環境に運び.代謝廃棄物や壊死・分解産物を運び出し.種細胞の生存・発達に栄養を与え.全体としてこの過程に寄与する生理環境を整備するには.適切な血液供給を速やかに確立する必要がある。 この生理的なプロセスを促進するために.代謝の微小環境が全体として維持されます。
骨組織工学の基本的なアプローチは.再吸収性の生体材料に種細胞を接種して細胞-足場複合体を形成し.体内に移植することである。 足場材料が分解されても.種細胞は増殖・分化を続け.マトリックスやサイトカインを分泌して.骨欠損部の修復を促進させることができる。 現在.組織改変骨のin vivoでの血管新生を促進するための研究は数多く行われており.代表的なものとして.血管束を巻く方法.血管先端をあらかじめ構成した筋肉カプセル.血管先端筋膜を巻く方法.複合血管内皮前駆細胞や血管内皮細胞.また血管新生を促進する足場材料の3次元構造改変や遺伝子導入.血管新生生理活性因子の徐放・制御放出技術などが挙げられる。 顆粒球コロニー刺激因子動員の使用は.循環しているEPCの数を増やし.人工インプラント材料の内皮化を改善するのに有効であることが分かっています。 また.EPCを組織工学の種細胞として使用することで.組織工学的に作られた骨の生体内血管新生を促進し.骨修復を促進することが研究で明らかにされています。
3.3 骨修復におけるEPCの治療と応用
組織工学は.機能的に重要な細胞を天然または合成の足場上で培養し.新しい機能的な組織や臓器を得ることであるが.ほとんどの組織や臓器は.栄養分の供給や代謝物の運搬に微小血管網を必要とする。
Schmidtらは.ヒト臍帯血から内皮前駆細胞を分離・培養し.ヒト血管平滑筋細胞とともに足場に接種し.ポリグリコール酸ポリ乳酸コポリマー中に毛細血管様構造を形成できることを見出した。 Schultheissらは.平滑筋細胞と膀胱上皮細胞を.血管構造を保持した脱細胞化ブタ小腸セグメントに接種することにより.組織工学的膀胱を構築した。 組織工学研究の重要な分野の一つである骨組織工学研究は.いくつかの面でエキサイティングな結果を出し.初期の臨床応用に用いられており.組織工学の中で最も有望で実行可能な分野の一つと考えられている。
これらの実験結果は.血管内皮前駆細胞を用いた組織工学的な骨の構築は有望であり.長節骨欠損の治療に大きな可能性を持っていることを示唆している。
4.まとめと展望
血管内皮前駆細胞は.組織工学の分野での応用が期待されていますが.研究は始まったばかりで.表面マーカーや最適な培養系など.解決すべき課題はまだ多く残っています。 今後の研究により.血管の表現型.組織のリモデリングにおける役割.生物学的特性.治療効率の向上や副作用の軽減に向けた応用など.画期的な成果が得られると期待されています。 EPCは組織工学的な種細胞の一つとして.自己細胞治療や遺伝子改変の概念の登場により.再生医療における臨床応用に大きな可能性を示しています。