I. ヌクレオシド（酸）アナログに対する耐性のウイルス学的基礎
HBVは体内に侵入後.標的細胞膜上の受容体と結合し.エンベロープを脱ぎ捨てて細胞質に入り.核カプシドを脱落させ.二本鎖の環状HBVDNAの一部が標的細胞核に入り.DNAポリメラーゼの作用により.負鎖DNAを鋳型にして正鎖を伸ばし.クレフト領域を修復して共有結合閉ループDNA（ccCDNA）を形成します。 HBVDNA複製では最初にccCDNAを 鋳型は.宿主のRNAポリメラーゼの働きにより.3.5kb.2.4kb.2.1kb.0.7kbに転写されます。
HBVはDNAウイルスであるが.その複製過程は直接DNA-DNA複製過程ではなく.プレゲノムRNAの中間過程.すなわちDNA-RNA-DNA複製過程である。 HBV逆転写酵素は.プレゲノムRNAを負鎖DNAに逆転写する過程で.厳密な補正機構を持たないため.HBV複製時の塩基ミスマッチ率が高く.他のDNA・RNAウイルスと比較して約1/105である。このHBV複製の過程と特徴から.同じ患者でもHBV株によって遺伝子配列に違いがあることが決定された。 このように.各患者のウイルスは.遺伝子配列の異なるウイルス株からなる動的に変化するウイルス集団.すなわち準種として存在する。
HBVウイルス集団の進化は.ダーウィン進化論とも一致する。 ある遺伝子座の変異は致死的であり.そのような変異を受けたHBVは生き残ることができない。 ある遺伝子座の変異はその複製能力に大きな影響を与えないが.多くの遺伝子座の変異は子孫のウイルスの複製を減少または促進させる結果となる。 ウイルス集団における異なる遺伝子配列を持つウイルス株の相対的な割合は.一方では株自体の複製能力に依存し.他方では身体の免疫系や薬剤の選択圧の影響を受ける。
ヌクレオシド（酸）類似化合物の作用機序：体内に入ると三リン酸の活性成分を形成し.体内の天然デオキシ三リン酸ヌクレオシドと競合的に結合してHBVポリメラーゼに作用します。 しかし.3リン酸化されたヌクレオシド（酸）類似体は天然のdNTPの構造を持たないため.HBVのDNA鎖合成は終了し.これがヌクレオシド（酸）類似体がHBVの複製を阻害するメカニズムである。 しかし.患者のHBVの塩基配列が変異しており.ヌクレオシドアナログとの結合能が低下したHBVポリメラーゼが生成している場合.変異したHBVはヌクレオシドアナログによって阻害されないか.阻害する能力が低下していることになります。 そのため.ヌクレオシドアナログ療法を継続すると.野生株はヌクレオシドアナログに感受性があるため抑制され続け.変異株は一定の複製能力を持ち.ヌクレオシドアナログに感受性がないため徐々に野生株に取って代わって体内のHBVの優勢株となり.患者のヌクレオシドアナログに対する薬剤耐性につながるのである。
ヌクレオシド（酸）アナログ耐性変異体に関する概念と命名法について
(I) 薬剤耐性変異体に関する考え方
HBVの薬剤耐性変異体に関する一般的な用語や概念は以下の通りです。
1. 一次治療不成功：ヌクレオシド（酸）アナログによる12週間の治療で.HBVDNA量の減少が1log10IU/ml未満であることを指す。一次治療失敗は.宿主.薬剤.ウイルスなどの要因に関連すると考えられる：患者のコンプライアンスが悪い.薬剤の吸収が悪い.体内で有効成分に変換する能力が低い.薬の抗ウイルス効果が弱い.治療量が少なすぎる.HBVの薬剤抵抗性がある。 一次治療がうまくいかないのは.突然変異などが原因である可能性があります。
2.ウイルス学的ブレークスルー：治療期間中に1ヶ月間隔で2回連続して検査を行い.血清HBVDNA量が奏功後の最低値より1log10以上上昇した場合を指し.治療コンプライアンスが良好な患者さんのウイルス学的ブレークスルーは.しばしば薬剤耐性の発現を示唆します。
3.ウイルスリバウンド：治療後にウイルス学的効果が得られ.治療を継続したにもかかわらずHBVDNA量が20,000IU/ml以上または治療前のレベルより上昇した患者を指します。
4.生化学的ブレークスルー：治療により血清ALT正常化が達成された後.治療継続中にALT値が上昇し.正常値の上限を超えることをいう。 ALTの値が正常値の上限の5倍以上になると.肝炎ブレイクスルーと呼ばれます。
5.一次薬剤耐性変異：薬剤の標的部位にコードされる遺伝子やアミノ酸に変異が生じ.変異ウイルス株の治療薬に対する感受性が低下することを指す。 例えば.rtM204V/Iの変異株は.LAMに対する感受性が著しく低下している。 一次耐性変異株は薬剤に対する耐性が向上しているが.変異ウイルス自体の複製能力の低下を招くことも多い。
6.二次的薬剤耐性変異：一次薬剤耐性変異株の複製能の低下により.一次薬剤耐性変異を基盤として他の遺伝子座でも変異を起こし.これらの変異により変異ウイルスの複製能が一部回復したり.薬剤に対する感受性がさらに低下したりすることがある。 例えば.LAMの薬剤耐性変異のうち.rtM204V/Iは主要な薬剤耐性変異であり.代償的な薬剤耐性変異としてrtL180M変異を伴うことが多い。
7.ジェノタイプ耐性：in vitroでの表現型解析試験において.抗ウイルス剤耐性と関連することが示されたHBVの変異体を検出することを指します。
8.表現型耐性：試験管内複製系で検出されるHBV変異体が.抗ウイルス剤に対する感受性を低下させることが確認されているもの。 ウイルスの複製を阻害するのに必要なEC50が野生株に比べて100倍以上増加した場合.高度耐性.10-99倍中等度耐性.2-9倍軽度耐性と呼ばれる。
9.交差耐性：あるヌクレオシド（酸）アナログに耐性を示すHBV変異体は.他の1つ以上のヌクレオシド（酸）アナログにも耐性を示す。 例えば.LAM処理は.LdTにも耐性を持つrtM204Iの耐性変異体で発生します。
10.多剤耐性：順次または同時治療のための異なる標的薬.HBVは異なる薬剤耐性変異.ウイルスの複数の薬剤耐性変異株の生産のターゲットで発生することができるときに指します。 LAM投与後にrtM204V/IとrtA181T/Vにウイルス変異が生じた場合.その株はLAMとADVの両方に耐性を示す。
ウイルス耐性の基礎となるのは遺伝子の変異である。 臨床では.まず遺伝子の変異が起こり.次にウイルス学的なブレークスルーとウイルスリバウンドが起こり.そして生化学的なブレークスルーが起こるとされています。 臨床ウイルス耐性検査結果の解釈は.ウイルス量.検査試薬・方法.臨床像の変化と統合する必要があります。
(ii) 薬剤耐性に関する命名法および記述形式
HBVポリメラーゼは.末端タンパク質.スペーサー領域.逆転写酵素領域の4つの異なる機能領域に分けられる。 HBV逆転写酵素の8つの遺伝子型は334個のアミノ酸残基から構成されているので.現在の国際的なHBV薬剤耐性バリアントのジェネリックはrt1番目のアミノ酸残基から始まり.「rt-野生型アミノ酸略号-逆転写酵素領域の開始点に対するアミノ酸変異部位-後の変異」という形式で表記される。 例えば.rtM204Vは.逆転写酵素領域の204位がメチオニン（M）からバリン（V）に変異していることを意味する。 同一部位に2つ以上のアミノ酸変化がある場合.すなわち混合HBVウイルス群の場合は.両方のアミノ酸変化を記載すること。
ヌクレオシド（酸）アナログの共通耐性部位と変異の発生率
1.ラミブジン耐性関連バリアント：利用可能な研究によると.LAM共通の耐性関連バリアントはrtM204I/V±rtL180Mバリアントで.そのうちrtM204VはほとんどがrtL180Mバリアントと組み合わせて発生し.rtM204Iバリアントは単独で発生することがあります。 LAMで治療された患者さんにおける.公表されている主要なヌクレオシド（酸）アナログのPivotaltrialsに基づく1-5年後の累積耐性発生率はそれぞれ24％.38％.49％.67％.70％となっています。
2.アデフォビル耐性に関連する変異：利用可能な研究は.ADVにおける一般的な耐性関連変異がrtN236TおよびrtA181V/T変異であり.これらは単独または複合して発生し得ることを示唆しています。 ADVのヌクレオシド（酸）類似体による治療を受けた患者の主要臨床試験の公表データに基づくと.HBeAg陰性患者の1～5年後の累積耐性発生率は.それぞれ0%.3%.11%.18%.29%であることがわかりました。
3.エンテカビル耐性に関連する変異体：今回の結果から.ETV耐性に関連する変異体は.rtM204V+rtL180M変異体に.rtT184.rtS202.rtM250の3座位のうち少なくとも1つのアミノ酸置換変異を組み合わせたものがベースになっていると考えられます。 一次治療としてヌクレオシド（酸）アナログで治療した患者におけるETVの主要臨床試験の公表データに基づく.1年から5年での累積耐性。
4.テルビブジン耐性に関連するバリアント：現在のところ.LdTの耐性に関連するバリアントはrtM204Iが一般的である。 rtA181V/T など他の部位はまだ議論のあるところである。 一次ヌクレオシド（酸）アナログで治療した患者を対象としたLdTの主要臨床試験の公表データに基づく1年目および2年目の耐性累積発生率は.それぞれ4％と22％である。
それぞれの薬剤に関わるB型慢性肝炎の集団や設計が異なることに留意する必要があります。
B型肝炎ウイルスの薬剤耐性変異体の検出と解析
(a) 一般的な遺伝子型薬剤耐性検出技術
PCR産物の直接塩基配列を決定する方法は.HBVゲノムの逆転写酵素領域を増幅した後.直接塩基配列を決定して解析する方法であり.HBVゲノムの塩基配列を決定する方法は.HBVゲノムの逆転写酵素領域を増幅した後.直接塩基配列を決定する方法である。 この方法の欠点は.感度が低く.変種がHBV準種プールの20％を超えたときのみ検出できることである。
2.ポリメラーゼ連鎖反応-制限酵素断片長多型：この方法は感度が高く.HBV準種プールの5％を占める薬剤耐性変異体を検出でき.国内外の多くの研究所でLAM薬剤耐性変異体検出に使用されている。 しかし.PCR-RFLPは既知の単一部位変異しか検出できず.少数の耐性変異をモニタリングするための簡便.迅速かつ安価な方法である。 しかし.複数のヌクレオシド（酸）アナログの導入やHBV耐性変異体の出現により.この方法は多座変異体の検出には適さなくなると考えられる。
3.リバースハイブリダイゼーション：本技術を用いたINNO-LiPA法は.海外で臨床検査が承認されており.現在.LAM.ADV.ETV.LdTなどの一般的な耐性遺伝子座を検出することが可能です。 この方法は.HBV準種プールの5〜10％を占める変異株を検出できるため.感度は良好ですが.既知の遺伝子座変異しか検出できず.さらに検査費用が高いため.中国での臨床検査に広く使用されることは困難です。
4.Real-time PCR法：本法は簡便であり.薬剤耐性変異体を10％以下の変動率で検出することが可能です。 欠点は.既知の部位しか検出できないことである。同時に.部位ごとに異なるバリアントでは.対応するプローブを合成する必要があり.ヌクレオシド（酸）アナログ耐性部位の数が増えると.対応する合成プローブのコストが高くなることである。 中国では.SFDAが承認したrtM204V/I変異体の臨床検査用リアルタイムPCRキットが販売されています。
5.遺伝子チップ：DNAチップ.DNAマイクロアレイとも呼ばれ.迅速.効率的.高感度.並列化.自動化の利点を持ち.既知の変異遺伝子座を検出することができる。 また.遺伝子チップのハイスループットシーケンス技術の進歩により.未知のバリアント遺伝子座の検出にも利用できるようになりました。 現在.ヌクレオシド（酸）アナログの臨床検査用の国産マイクロアレイを開発中である。
6.制限酵素質量分析多型技術：この技術は.PCR-RFLP技術とマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析技術を組み合わせたもので.感度が高く.HBV準種プールの1％未満の変異株を多数検出することができますが.既知の遺伝子座変異しか検出できないことや高価で.臨床への応用が進みにくいことも特徴です。
(ii) In vitroでのフェノタイピング
In vitroでの表現型検査は.遺伝子型耐性を確認するための「ゴールドスタンダード」であり.有効濃度の半分の濃度での耐性レベルを評価するためにしばしば使用されます。 原理は.試験する薬剤耐性変異体を含むHBVの全ゲノムを肝細胞由来の細胞株に導入し.細胞培養液中に濃度勾配の異なるヌクレオシド（酸）類似体を添加し.一定の培養時間後に薬剤の作用下でHBVDNAの複製を検出しEC50を算出するもので.HBVDNAの複製を検出することはできません。 の感受性を高める。
(iii) 仮想的な表現型解析
バーチャルフェノタイピングの前提として.臨床情報.遺伝子型.表現型耐性情報が相互に関連したHBV薬剤耐性変異体のデータベースが構築されています。 配列が解析のためにデータベースに提出されると.データベースは最も近いHBV配列を探し.一致した配列の臨床検査や薬剤耐性検査に基づいて.解析対象の配列の薬剤耐性変異を推定する。 表現型耐性の研究の補助として.バーチャルフェノタイピングはin vitroの表現型に代わるものではありませんが.既知の耐性バリアントのモニタリングや新しいバリアントの発見を促進することができます。 現在.利用可能なデータベースには.オーストラリアのものがあります。
V. B型肝炎ウイルスの薬剤耐性変異の臨床的管理
(i) B型肝炎ウイルス薬剤耐性変異体の予測因子
ヌクレオシド（酸）アナログに対するHBV耐性が発生する確率には.適用したヌクレオシド（酸）アナログの種類.初回治療時のHBVDNA量.基礎にある肝線維症／肝硬変の存在.ヌクレオシド（酸）アナログによる抗ウイルス治療の経験など様々な要因が関連していると考えられます。 また.男性患者.高体重指数.アルコール依存症なども.抗ウイルス療法における耐性変異の高リスク因子とされています。 しかし.初期のウイルス学的反応が薬剤耐性発生の重要な予測因子であることを示唆する研究が増えてきています。
(ii) B型肝炎ウイルスの薬剤耐性変異の予防戦略
1.ヌクレオシド（酸）アナログ系抗ウイルス剤の適応の合理的選択：ヌクレオシド（酸）アナログ系抗ウイルス剤は.免疫抑制剤や化学療法剤による治療を必要としない.特に若い年齢層の免疫寛容者や不活性HBV感染者には推奨されません。 活動性の慢性HBV初感染患者.特に若年層では.その素因を十分に分析して.ヌクレオシド（酸）アナログの使用を慎重に決定する必要があります。
抗ウイルス剤治療法の合理的な選択：治療法は.中国のB型慢性肝炎の予防と治療に関するガイドラインを参照することが推奨されます。 抗ウイルス療法の適応がある患者に対して.ヌクレオシド（酸）アナログを使用する場合は.抗ウイルス効果が強く.薬剤耐性の変動が少ない薬剤の使用を心がけると同時に.ヌクレオシド（酸）アナログの適用.治療効果.薬剤耐性変動など過去の抗ウイルス療法を把握し.交差耐性のない薬剤療法を選択することが重要である。 また.多剤耐性の発生を避けるため.単剤での逐次投与はできるだけ避けなければならない。
3.コンプライアンス向上：ヌクレオシド（酸）類似化合物による抗ウイルス治療中は.時間通りに十分な量を服用するよう.医師のアドバイスを遵守することを繰り返し強調することが重要である。 臨床試験データの分析によると.ウイルス学的ブレークスルーの30％以上は.患者のコンプライアンス不良が原因であることが分かっています。 いずれにせよ.漸減投与法は間違いであり.薬剤耐性のリスクを著しく高めることになる。
4.治療レジメンを適時に調整するためのHBVDNAおよびジェノタイプ耐性の標準的モニタリング：HBVDNA負荷は.ヌクレオシド（酸）アナログを抗ウイルス治療に適用する際の耐性モニタリングの最も重要な指標である。 治療中は定期的にHBVDNA濃度を検査する必要があります。 多くの臨床試験で.早期ウイルス学的反応が薬剤耐性発生の重要な予測因子であることが示されており.APASLとEASLの両ガイドラインは.有効性を高め薬剤耐性発生を抑制するために.早期ウイルス学的反応に応じて治療レジメンを調整することを推奨しています。
遺伝子型別耐性検査は.ヌクレオシドアナログ系抗ウイルス剤治療のルーチン検査としては推奨されません。 遺伝子型別耐性検査は.ヌクレオシドアナログ系抗ウイルス剤治療中にウイルス学的ブレークスルーを経験した患者において.最初の患者がヌクレオシドアナログ系抗ウイルス剤治療中の患者からのHBV感染であるという明確な証拠がある場合を除いて実施されるべきものです。 一次治療中の患者の遺伝子型別耐性検査は.一般に推奨されない。
(iii) 薬剤耐性亜種を発症した患者の臨床管理に関する推奨事項
治療前のALTが正常で.肝組織学的に軽度の炎症性または線維性病変を有する少数の患者に対して。