過去10年間で.中国でB型慢性肝炎の治療薬として承認された薬剤は.一般的なインターフェロン1種類から.ペグインターフェロン.ラミブジン.アデホビル.エンテカビル.チピフジン.さらに海外ではテノホビル.エムトリシタビンを含む6種類に増加しました。 ヌクレオシド（酸）系薬剤はインターフェロンに比べ服用しやすく.副作用も少ないが.48週間のコースを中止した後.持続的なウイルス抑制が得られないことが多く.コースを無期限で延長することもある。 B型慢性肝炎の抗ウイルス療法が失敗する最も重要な理由は.ウイルス抵抗性と患者のコンプライアンス不良の2つである。
ヌクレオシド（酸）系薬剤による治療失敗は.一次治療失敗（初回治療に反応せず）.二次治療失敗（抗ウイルス治療開始後3ヶ月以内に血清中のB型肝炎ウイルス（HBV）DNA濃度の減少が1×log10 IU/ml未満）と定義され.二次治療失敗とは.抗ウイルス治療の初期効果がある（3ヶ月以内に血清HBV DNA濃度の減少が1×log10 IU/ml以上）ことと定義されている。 二次治療失敗の最も重要な原因は.ウイルス変異と薬剤耐性です。
I. B型肝炎ウイルスの複製とその変異の生成の特徴
HBVのDNAが複製される過程では.逆転写のプロセスが必要であるが.ウイルスの逆転写酵素は3′-5’ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ活性を持たないため.ミスマッチしたヌクレオチド（酸）を証明できず.HBV DNAの自然複製エラー率は他のDNAウイルスに比べて10倍程度となる。 HBV遺伝子の複製時の自然変異により.未治療のHBV感染者では.同一ではないが非常に類似した遺伝子配列を持つウイルス株群である準種がしばしば発生する。 HBV DNAのリーディングフレームが重複しているため.ほとんどのHBV DNA準種はその複製能力が低下し.ある環境における優勢株は.ある選択圧の下で最大の複製能力を持つ準種となります。
内生的（宿主の免疫反応）および外生的（抗ウイルス薬やウイルス感染過程）な選択圧力のもとでの変異型HBV株のプール（準種）の存在は.HBVの生存に有利で.免疫反応（プレC領域やe抗原の逃避）.予防ワクチン（ワクチンの逃避）および抗ウイルス薬（ウイルス耐性）の前に変異型逃避株が存在することを可能としている。
HBVの抗ウイルス剤に対する耐性は.選択的な薬物圧力のもとでウイルスが適応的に変異することにより.薬物阻害に対する感受性が低下することを反映している。 耐性変異には.ウイルスの薬剤感受性を直接的に低下させる「主要耐性変異」と.主要耐性変異はウイルスの複製適性の低下を伴う傾向があるため.ウイルスの複製を促進する可能性がある「代償耐性」の2種類が確認されています。
代償性薬剤耐性バリアントの重要性は.準定型記憶の遺伝子プールにおける薬剤耐性バリアントの欠落を補う能力にある。 薬剤耐性変異体の出現の兆候としては.ウイルス量の増加（通常は1logIU/ml超の直流から）.ウイルスポリマー領域における既知の遺伝子耐性マーカーの存在.血清グルタミナーゼの増加.そして最終的には臨床症状の悪化が挙げられます。
II.B型肝炎ウイルス抵抗性の発現に関連する因子
HBV耐性の発現は.少なくとも6つの要因に依存している。
(1)ウイルスの複製量と複製速度。
(2)ウイルスポリメラーゼの忠実度。
(3)薬剤の選択圧力。
(4)肝臓の複製スペースの総量。
(5)薬剤耐性ウイルス株の複製適応。
(6)薬物に対する遺伝子のバリアー。
1.ウイルスの複製数と速度 HBVの複製数が多いため.ウイルスの更新速度が速く.慢性感染者の血清中の循環ウイルス濃度は108-1010個/ml以上になることが多い。 循環するウイルスの半減期を1日と仮定すると.新しいウイルス粒子も毎日1011個以上作られている。HBVゲノムは3200塩基対で.ポリメラーゼのミスマッチ率は10-4〜10-5/塩基/サイクルであり.循環するウイルス全体では多数の変異ゲノム（準特異）があり.各塩基は毎日変化しているかもしれない。
HBVの準種族プールにおける優勢株の安定性の維持は.宿主の自然免疫系および適応免疫系からの特定の選択圧と.ウイルス自体の生存・複製能力に依存している。
2.ウイルスポリメラーゼの忠実度 HBVの突然変異率は約1.4〜3.2×10-5アミノ酸置換/部位/年であり.他のDNAウイルスの約10倍で.レトロウイルスなどのRNAウイルスと一致する。 HBVポリメラーゼは細胞性ポリメラーゼとは異なり.逆転写酵素であり.修正活性を持たない。 HBVの準種族プールが存在するため.抗ウイルス療法を行う前に.薬剤耐性に関連する1つまたは2つの変異を持つ変異株が存在する可能性があります。
3.薬剤の選択圧 治療中に耐性関連変異体が選択される確率は薬剤の効力に依存し.この確率はベルカーブで表すことができる。 抗ウイルス力の低い薬剤は.ウイルスに大きな淘汰圧を与えず.耐性株が出現するリスクは高くはない。 逆に.突然変異はウイルスの複製に依存しているので.ウイルスの複製を完全に阻害する薬剤は.突然変異が生じる機会もほとんどない。
単剤療法は.単一の標的部位で程度の差こそあれ抗ウイルス作用を発揮するため.耐性変種を選択する可能性が高くなります。 理想的な治療レジメンは.ライフサイクルのさまざまな段階でウイルスを抑制するため.薬剤耐性のリスクを大幅に軽減することができます。 薬剤の選択圧がある場合.耐性はウイルスの複製が存在する場合にのみ発生する。
肝の複製空間 HBVの複製空間とは.肝臓が新しい転写鋳型やcccDNA分子を受け入れる可能性のことである。 このことは.最終的にウイルス変種が受け入れられるかどうかは.元の野生ウイルス株の消耗に依存し.ウイルス複製の適応や肝細胞の増殖・更新など他の要因の影響を受けることを示唆している。 正常な肝臓では.肝細胞の再生は遅く.半減期は約100日である。 炎症活性や毒性時には.半減期は10日未満に減少する。
完全感染肝では.新生HBV cccDNA分子は非感染肝細胞の生成時にのみ合成され.これは通常の肝成長.肝細胞の増殖および更新.あるいは感染肝細胞における野生型ウイルスからのcccDNAの枯渇によって獲得することが可能である。
薬剤耐性ウイルス株の複製適合性 複製適合性は.自然淘汰圧のもとで子孫を残す能力と定義でき.収量ではなく.in vitroの共感染競争アッセイで測定されるが.HBVに適した細胞培養系がないため.この方法はHBVに適用できない。 Thibaultらはラミブジン耐性HBVの患者間感染を最初に報告し.他のグループはラミブジン耐性株が薬剤中止後少なくとも3カ月間は野生型HBVと共優性株として共存し.薬剤中止後約1年後には野生型HBVと非優性株として共存できることを明らかにした。
ヌクレオシド（酸）系薬剤の遺伝的障壁は.主要な薬剤耐性変異体に必要なヌクレオチドの変異の数である。 LMVのようなレボヌクレオシドやADVのような非環状硫酸塩の場合.必要な変異は1つだけである。 例えば.rtM204IはLMVに.rtN236TはADVに抵抗が発生します。 シクロペンタンクラスのメンバーであるETVの場合.少なくとも3つの変異が必要である：rtM180LとrtM204Iに加えて.rtI169.rtS184.rtS202.rtM250のうち1つが必要である。
7.その他の要因 抗ウイルス剤治療に影響を与える宿主側の要因としては.過去の薬歴.コンプライアンス.宿主の遺伝的要因（先天的な代謝異常など）.細胞内のリン酸化（肝細胞内の救済酵素クラス）を通じてヌクレオシド類似体を活性代謝物に効率的に変換する能力などがあります。 さらに.抗ウイルス剤の効力が及ばない隠蔽部位が存在する可能性があり.HBVの重要な複製中間体であるcccDNAは.一般に従来の治療法に感受性がないことが分かっています。
第三に.異なるヌクレオシド（酸）系薬剤の特異的な耐性パターンについて
現在.中国で入手可能な薬剤の1つのクラスは.ラミブジン（LMV）やテルビブジン（LdT）などのレボデオキシシチジン類似体.第2のクラスはアシクロリン酸塩のアデホビル（ADV）.第3のクラスはデオキシグアノシン類似体のエンテカビル（ETV）などのシクロペンタン系薬剤となっています。 その化学的分類は.ヌクレオシド（酸）アナログに対する耐性のパターンや経路に影響を与える可能性があるため.強調されています。
LMV耐性バリアント LMV耐性バリアントは.HBVポリメラーゼの触媒領域（C領域として知られている）のYMDD配列上に存在する。LMV治療中に選択される主な耐性バリアントは.RT領域.rtM180L（B領域）を伴うか伴わないrtM204I/V/S（C領域）である。 ラミブジンに対する耐性は.治療期間中.年間14〜32％の割合で増加している。LMVの主要な耐性変異であるrtM204V/Iは.LDTには交差耐性を示すが.ADVには耐性を示さない。 ADVを用いたが.rtA181Tを用いない。 注目すべきは.rtM204V/IがETVに対する感受性を低下させることである。
in vitroの実験では.LMVに関連する薬剤耐性変異はLMVに対するウイルスの感受性を少なくとも100倍.さらには1000倍以上低下させている。rtM204I変異は単独で存在しうるが.rtM204VとrtM204SはA領域またはB領域の他の変異を伴うだけである。 ラミブジン耐性の分子機構は.ポリメラーゼのYMDDモチーフのメチオニンがバリンまたはイソロイシンに置換され.そのβ-メチルによってラミブジン三リン酸結合空間が減少し.ラミブジン三リン酸がHBVポリメラーゼに結合しない空間障壁が形成されることにある。
LDT耐性バリアント テビブジンは天然のチミジンデオキシヌクレオシドのL-エナンチオマーであり.耐性部位はラミブジンと同様.いずれもYMDD領域に存在し.rtM204I置換が最も高頻度に出現するバリアントである。
ADV耐性バリアント アデフォビル耐性は.当初ポリメラーゼB領域のrtA181TとD領域のN236Tの変異に関連していることが判明していた。 Adefovir耐性変異株はLMV耐性に比べて少なく.投与2年後の耐性発現率は約2.3年は約4.4年は約18.5年は最大29である。rtN236TはLamivudineに対する感受性に大きな影響はないが.rtA181T/V変異株はLamivudineに対して一部交差耐性となる可能性がある。 逆転写酵素領域の別の変異体（rtI233V）も.ADV耐性と関連することが示されている。 臨床研究により.rtI233V変異体はCHB患者全体の約2人に見られることが示されていますが.ADV治療の失敗や不応答におけるこの変異体の正確な役割は.現在のところ不明です。
ETV耐性変異体 エンテカビル耐性は.当初ラミブジン耐性患者のみに発現し.主にB領域のrtI169TまたはrtS184G.C領域のrtS202I.E領域のrtM250Vなどのウイルスポリメラーゼ遺伝子の変異が関連している。ラミブジン耐性がない場合.rtM250VはIC50を9倍に高めるが.rtT184G＋rtS202Iではこの効果がない。ラミブジン耐性がない場合，rtM250VはIC50を9倍増加させたが，rtT184G + rtS202Iは増加しなかった。rtL180MおよびrtM204V変異体がある場合，IC50は100倍以上増加する可能性がある． 最近.プライマリーケア患者において.ETVの一次耐性変異体が報告されています。 プライマリーケア患者におけるエンテカビル投与1年目の耐性化率は非常に低く.5年目でも1.3程度ですが.ラミブジン投与歴のある患者では.エンテカビルに変更して4年後の耐性率が40と高く.エンテカビルに変更することで.より高い効果が期待できます。
rtT184GとrtS202I変異体の組み合わせに対する抵抗性のメカニズムは.ヌクレオチド結合領域の形状の変化とYMDDモチーフの近くに位置する鋳型DNAへのポリメラーゼの結合の変化を含む構造変化である。rtM250V抵抗性はDNA鋳型鎖.プライマー鎖および新たに組み込まれたdNTP間の結合変化によるものである。
ポリメラーゼ領域とS領域の遺伝的重複による問題点
HBVウイルス外膜（S-抗原）遺伝子はポリメラーゼ遺伝子と完全に重なっているため.ヌクレオシド（酸）系薬剤耐性変異体はS-抗原に変化をもたらす可能性があるのです。 ポリメラーゼとS-抗原の遺伝的重複は.(rtV173L+rtL180M+rtM204V)などの一般的なラミブジン耐性変異体がS-抗原に重要かつ重大な変化を持ち.in vitroアッセイにおけるS-抗体（ワクチン関連）への結合を著しく低下させることから重要であると考えられる。 同様に.rtA181Tはadefovir治療が無効となった患者の40例以上で単独またはrtN236Tとの関連で見つかる。Rt領域のrtA181T変異は.それと重なるS抗原のSw172（ストップコドン）変化を引き起こす可能性がある。
WarnerとLocarniniらは.このHBVの変種は分泌機能に欠陥があり.ウイルス粒子が細胞内に保持されること.この変種がHBVの野生株からのウイルス粒子の分泌を阻害することを見いだした。 これらの研究の臨床的意義は.この変異体が（共）選択された場合.耐性のウイルス学的定義（1ヶ月以上間を置いた連続した2検体でHBV DNAが直流から1 logIU/ML以上上昇すること）はもはや適用されないことです。rtA181Tは出現し.ウイルス量は12ヶ月にわたって直流から徐々に増加しただけでした。 したがって.抗ウイルス療法を行う場合には.ウイルス量の観察に加えて.ジェノタイピングやポリメラーゼ領域シークエンスを実施する必要がある。
結論
HBVのヌクレオシド（酸）アナログに対する耐性は，薬剤選択の圧力のもとでのHBV準種族の変異株のスクリーニングが本質である。 cccDNAの長い半減期と感染肝細胞の長い寿命から，B型慢性肝炎患者の長期治療とモニタリングが必要であり，この間，ウイルス耐性変異株の出現を予防または低減し抗ウイルス治療の有効性を高めるためには適切な薬剤および治療レジメンを選択することが必要である。 HBVのポリメラーゼ領域には複雑なパターンの薬剤耐性変異が出現し.さらに多数の代償性変異が存在するため.その後の救済治療には妥協した戦略を選択せざるを得なくなっています。
ウイルス量.HBVの遺伝子型.ポリメラーゼ領域の塩基配列の正しい解釈についてはさらなる研究が必要であり.改善療法を知らせるための利用可能でより広範な対話型データベースプログラムも大いに必要である。 長期にわたってウイルスの複製を効果的に抑制することができれば.ウイルス量は新しい薬剤耐性ウイルスパラタイプの出現が考えにくいレベルまで低下します。