椎間板変性症の生物学的治療には.様々な治療アプローチがあります。 治療法には大きく分けて.細胞療法.マトリックス療法.分子療法があるが.本章では分子療法に焦点を当てる。 治療用分子には.古典的な「成長因子」だけでなく.あらゆる種類の治療用分子が含まれます。 成長因子は細胞の分裂に影響を与えることから命名されているため.この命名法は重要である。しかし.有効な治療用分子の治療効果は.必ずしも細胞の複製に影響を与えることによって達成されるとは限らないのだ。 治療分子は.代謝拮抗剤.アポトーシス促進因子.軟骨形成剤.細胞内調節分子に分類される。 本章では.主な文献を検証し.それぞれの分類を定義する。 椎間板変性の過程を理解することは.分子療法を理解する上で有用である。 椎間板変性の過程では.髄核マトリックスからプロテオグリカン.水分.II型コラーゲンが失われる。 高分子プロテオグリカンなど.マトリックスの不確実な変化の中には.定量化が困難なものもある。 線維輪の変化には.環状薄板の破壊とコラーゲンマトリックスの欠陥が含まれます。 一般に.このようなマトリックスの変化は何年もかかり.主に合成と異化の間の不均衡が原因である。 分子療法の目的は.合成と異化のバランスをとることで.椎間板の細胞外マトリックスの変化を止めることです。 具体的な分類は以下のとおりです。 I. 代謝防止効果 マトリックスの減少は合成と異化のバランスなので.合成を増やすか異化を減らすかすれば.ディスクの細胞外マトリックスを増やすことができる。 細胞外マトリックスには多くの異化酵素が存在するが.その中でもマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は.細胞外マトリックス分子のリサイクルや椎間板変性に重要な役割を担っているグループである。 この仮説は.変性した椎間板でMMPのレベルが有意に高いことから支持される。 細胞外マトリックスにおいて.MMPの阻害剤は主にマトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤（TIMPs）である。Wallachは.これらの抗異化分子（TIMP-1）が.in vitroアデノウイルス遺伝子導入経路を介してマトリックスのプロテオグリカンの量を増加させることができるかどうかを検証した。 彼は.椎間板細胞にTIMP-1を発現させると.確かにプロテオグリカンの量が増加し.またプロテオグリカンの合成速度が測定によって増加することを発見した。 もう一つの強力な分子は.ヘスペリジンの前駆体でありながら薬物動態に優れたCPA-926です。 CPA-926は.抗炎症作用や抗腫瘍作用.変形性関節症の軟骨変性防止作用を持ちます。OKUMAは.CPA-926を椎間板変性のウサギに経口投与して.高位椎間板変性の発生を予防または遅延させることができることを明らかにし.その結果 椎間板変性の組織学的証拠。 マトリックスの代謝率は.合成と異化のバランスという観点からも重要である。 例えば.椎間板の代謝率は高齢者より若年者の方が著しく高く.変性した凝集型プロテオグリカンや新たに合成された（軟骨由来の）凝集型プロテオグリカンなど.マトリックス組成の変化も起こり得る。 総代謝量は.ディスク細胞の栄養要求量にも影響します。 IL-1やTNF-aなどのサイトカインは.いずれも椎間板の代謝に重要な役割を担っている。 しかし.IL-1Raやインフリキシマブのように.それぞれIL-1やTNF-aの作用を阻害できる分子もあり.治療上も有用である。 代謝拮抗分子の研究が進めば.さらなる発見があるかもしれません。 II.プロアポトーシス因子 プロアポトーシス因子は.細胞の分裂率を高める分子の一種で.真の成長因子を構成しているので.インスリン様成長因子（IGF-1）.上皮成長因子（EGF）.繊維芽細胞成長因子（FGF）などの軟骨分子と区別することができます。 Thompsonは.成犬の椎間板細胞を用いて.IGFが分裂率とプロテオグリカン合成を増加させることをin vitroで証明したが.一般にEGFの方がより強力であった。 ラットの椎間板におけるIGF-1濃度は年齢とともに減少したため.研究者らは.高齢の椎間板ではIGF-1を増やすことでマトリックス合成を高めることができると結論付けた。ラットの尾椎間板圧迫の変性モデルにおける成長因子によるWalshのin vivo実験の結果は.Thompsonのin vitroの結果と一致し.いずれもIGF-1はわずかに効果を示したのに対し.FGF は基本的に効果がなかった。 他の成長因子も.同じメカニズムあるいは異なるメカニズムで椎間板細胞のアポトーシスを防ぐことができる。Gruberは.in vitroの低血清環境では椎間板細胞がアポトーシスするが.IGF-1またはPDGFを添加するとアポトーシスの割合が減少することを証明した。 組織培養アッセイでは.IGF-1はTIMP-2レベルを低下させたので.椎間板マトリックス代謝に2つの効果を持つと言われている III. 軟骨細胞形成ホルモン 軟骨細胞形成ホルモンは.アポトーシス促進能を持つサイトカインのクラスであるが.軟骨細胞特異的表現型を増加させるという主要な特徴を持つ。 これらの軟骨細胞特有の性質は.II型コラーゲン.Sox9遺伝子.凝集したプロテオグリカン.および 硫酸化アミノグルカン。 軟骨形成要素に関する研究の多くは.形質転換成長因子（TGF-b）.骨形成タンパク質（BMP）.成長分化因子（GDF）に関するものであった。 軟骨形成ホルモンは.正常な椎間板細胞の線維性表現型を軟骨性表現型に逆転させるということで注目されている。 これらの分子は.オートクライン.パラクライン.エンドクライン的に作用し.拡散して異なる細胞に作用することにより.大きな効果を発揮することができるのです。 原型となる軟骨形成細胞の活性は.関与する細胞の細胞外表面受容体と活発な細胞内メッセージシステムによって決定されるが.椎間板細胞はTGF.BMP分子と受容体を発現でき.その発現レベルは椎間板の加齢に伴って変化する。 TGF-b1は.ディスク形成分子として初めて同定された分子で.Thompsonは.TGF-b1が分裂促進物質であるだけでなく.細胞のプロテオグリカン合成を増加させることができる同化分子であり.プロテオグリカン合成の増加能力はEGF.IGF-1.PDGF.FGFなどの成長因子のそれよりも優れていると報告しています。 その後.西田はTGF-b1遺伝子を搭載したアデノウイルスベクターを免疫ウサギの椎間板に直接注入し.TGF-b1を発現させてプロテオグリカン合成を増加させることができることを示した。 また.ヒトの変性椎間板細胞を用いたin vitroアッセイでは.TGF-b1がプロテオグリカンとコラーゲンの合成速度を増加させることが示され.変性椎間板細胞は依然としてTGF-b1に対して感受性があることが示唆された。 ラット尾椎間板細胞を用いたin vitroアッセイでは.TGF-b1が内側線維輪細胞を増殖させる効果があることが示されたが.椎間板の高さに有意な変化はなかった。 TGF-b1にはこのような作用がありますが.ヒトの生きた椎間板におけるその役割はまだ証明されていません。 BMP-2も軟骨細胞形成の原型となる要素であり.Huttonは.組換えヒトBMP-2がラット椎間板細胞のプロテオグリカン合成を増加させ.軟骨細胞の表現型を有意に増加させ.また.凝集プロテオグリカンやII型コラーゲンの遺伝子発現が増加したが.I型コラーゲンには大きな変化がないことを報告している。 Kimは.BMP-2が椎間板細胞のプロテオグリカン合成に対するニコチンの阻害作用を一部逆転させたことを報告した。BMP-2は骨形成時に骨芽細胞の終末分化を促進することが知られているが.ヒト椎間板細胞を用いたin vitro試験で.BMP-2は軟骨細胞の遺伝子発現を増加するが骨芽細胞遺伝子には影響しないことが示されていることから.BMP-2は椎間板細胞の分化も促進するかどうかは未解明であった。 BMP-2の同化促進作用は.脊髄手術の際に椎間板細胞への遺伝子治療を試験管内で選択的に適用することでさらに実証された。 現在までのところ.BMP-2がヒトの生体内変性椎間板にどのような影響を与えるかについての研究はまだ行われておらず.注目されている。 BMP-7（別名：骨形成タンパク質OP-1）も椎間板の細胞増殖因子であり.増田はウサギの線維性環状体および髄核由来の椎間板細胞とBMP-7のin vitroでの増殖に用量依存的な関係があることを報告しています。 竹上氏は.アルギン酸環境下でラット椎間板細胞を増殖させ.炎症因子IL-1を添加すると.アルギン酸中のプロテオグリカンやコラーゲンが消失するのに対し.200mg/ml BMP-7添加後の培地中のプロテオグリカンやコラーゲンはIL-1非添加時よりもさらに多くなることを明らかにした。 Zhangは.BMP-7に反応して.in vitroで培養したウシ椎間板の3つの分画（それぞれ環状線維の外側ゾーン.内側ゾーン.髄核から）すべての細胞の増殖が増加することを報告しました。 しかし.環状線維の外側のゾーンと髄核の細胞だけが.プロテオグリカンの合成率の上昇を示したのである。 BMP-7のウサギの椎間板変性モデルでの試験が開始され.これらの試験でBMP-7を直接椎間板内に注入すると.椎間板の高さとプロテオグリカンのレベルが増加することが示された。 また.これらの試験データから.BMP-7の椎間板内注入は.ラットの椎間板変性にも有効であることが示唆された。 BMP-13は.成長分化因子（GDF-6）または軟骨由来形態形成タンパク質-2（CDMP-2）としても知られています。 BMP-13はBMPファミリーに属するが.そのアミノ酸配列はBMP-2と50％の相同性を持つに過ぎない。 BMP-13は.プロテオグリカン合成や軟骨細胞遺伝子発現においてBMP-2と相乗効果を示さないが.それらの複合効果は累積される。 BMP-13は大量に生産できるリコンビナントタンパク質ではないため.大量のBMP-13を必要とする研究は困難であった。 Walshは.ラット尾部椎間板変性モデルにおいて.GDF-5.TGF-b1.IGF-1.FGFの効果を比較し.生理食塩水コントロールと比較して.GDF-5が唯一.椎間板高さを増加させる分子であることを発見した。 また.組織切片では.繊維輪の内側帯と遊走帯の細胞の増殖が見られた。 しかし.繰り返し注射すると炎症反応が起こりやすく.生理食塩水の対照群でも同じ炎症反応が見られたことから.著者らはGDF-5ではなく.注射による傷害に起因すると考えている。Wangは遺伝子治療を用いて.GDF-5のアデノウイルス導入がin vitroでの培養椎間板細胞の成長を促進することを証明した。GDF-5は脊椎固定用に商業的に開発中だが.依然として多くの組み換えタンパク質が必要である 臨床試験用 ペレット培養アッセイでは.Link Nはプロテオグリカン合成を増加させるが.細胞数は増加しないことが示され.髄核由来の細胞ではII型コラーゲンが113％増加し.線維輪由来の細胞では25％増加することが確認された。 リンクNが軟骨細胞の重要なマーカー（II型コラーゲン）の特異的な発現を誘導し.細胞数を増加させないメカニズムはまだ不明である。 しかし.これらの知見は.リンクNが軟骨形成促進剤でもあることを既に示唆している。 細胞内制御分子は.膜貫通型受容体を介して作用しない特殊な分子である。 これらはサイトカインでも成長因子でもないが.先に述べた分泌型分子と同じような役割を担っている。 これらの分子は一般に.細胞分化の1つまたは複数の方向を制御している。 例えば.SMADはBMP-Rを制御する細胞内分子の一種である。 椎間板細胞におけるSMADの役割についてはまだ何も書かれていませんが.プロテオグリカンやII型コラーゲン合成を増加させるというBMP-2と同じ効果を椎間板細胞にも与えることができるのではないかという仮説が立てられています。 Paulは.Sox9遺伝子をアデノウイルスで導入すると.in vitroで椎間板細胞におけるSox9の発現とII型コラーゲン合成が増加することを実証した。 Sox9を搭載したアデノウイルスを体内に注入すると.ウサギの椎間板環状線維モデルで変性変化を防ぐことができた。 椎間板変性症モデルは.27ゲージの穿刺針を使用したため.椎間板へのダメージが少なく.変性も最小限に抑えることができました。 このin vivo試験の主な知見は.Sox-9を投与したディスクはコントロール群に比べ.より軟骨細胞様の表現型を持つことであったが.この報告では.ディスクマトリックスへの影響やin vivo試験の構成に関する定量的データは提示されていない。 LMP-1は.骨形成と骨芽細胞分化を促進する役割を持つ細胞内分子である。yoonは.椎間板細胞において.LMP-1が単層培養のみならず.長期（3週間）のアルギン酸培養アッセイにおいてもBMP-2.BMP-7およびプロテオグリカンの産生を制御することを見出した。 Yoonは.LMP-1の作用機序がBMP依存性であることを明らかにした。 その後.ウサギの椎間板を用いたin vivo実験により.少量のLMP-1を導入したアデノウイルスが椎間板組織中のBMP-2.BMP-7.プロテオグリカンのmRNAレベルを増加させることが示された。 LMP-1はBMP-2とBMP-7のヘテロ二量体形成を促進するため.その効果はホモ二量体の20倍にもなる。 誘導型スーパーBMPの作用下でアデノウイルスの投与量を減らすことにより.アデノウイルス遺伝子治療のリスク低減が可能であるという仮説があります。 V. まとめ 椎間板変性症に用いられる分子は.もはや古典的な成長因子だけでなく.少なくとも4つのクラスの分子があり.椎間板の修復作用がある。 代謝拮抗剤.アポトーシス促進因子.軟骨細胞由来のフォーマジェン.細胞内調節分子などがある。 椎間板変性症の動物モデルによるin vitroの試験データは少なく.in vivoの結果も非常に少ないが.現在のスクリーニング試験は終了しつつあり.近い将来.ヒトよりも先に椎間板変性症の動物モデルによる試験が開始されることになるだろう。