テストオブジェクトとメソッド
対象者
実験症例群
2012年1月から2013年10月までに.当院で脳神経外科手術を受けた12歳から65歳.平均39.6歳の神経膠腫患者36名（うち男性20名.女性16名）を実験グループとした。 感染症.神経疾患.腫瘍.自己免疫疾患を除外し.肝機能.腎機能が正常で.外傷や他の慢性疾患の既往がない患者を対象としました。 全例が当院病理部により神経膠腫と診断され.WHO脳腫瘍分類により低悪性度（グレードI-II）と高悪性度（グレードIII-IV）に分類されました。 実験群では.処置の24時間前.24時間後.72時間後.120時間後に脳脊髄液を採取した。 脳脊髄液採取後.直ちに脳脊髄液のルーチン生化学検査を行い.残った検体を4℃.4 000×r/minで10分間遠心分離し.上清を採取して直ちに-80℃の冷蔵庫で保存した（赤血球のあるものは廃棄した）。 対照群には手術群と同様の処置を施した。
正常対照群
対照群として.同期間に外来健診を受けた18例（26歳〜65歳.平均38.8歳.男性10例.女性8例）を抽出した。 性別構成と平均年齢については.実験グループと比較して有意差はなかった（P>0.05）。
実験方法
検体の測定はキットの説明書に従って厳密に行い.試薬プレートの各ウェルのOD値とブランクウェルのOD値の差を縦座標.標準物質の濃度を横座標として.相関曲線をプロットした。
統計処理
すべてのデータは平均値±標準偏差（±SD）で表し.統計ソフトSPSS17.0を使用して分析した。
結果
神経膠腫患者のCSFにおけるIL-6.IL-10.MMP-2.MMP-9のレベルを対照群と比較したところ.すべての測定値で有意な群間差が認められた。
高悪性度グリオーマと低悪性度グリオーマのCSFにおけるIL-6.IL-10.MMP-2.MMP-9レベルの違い。
WHO脳腫瘍分類（1997年）に従って診断された神経膠腫36例のうち.低悪性度から中悪性度の神経膠腫（以下.グレードI-II群）17例（星細胞腫グレードI.II 14例.脳室性髄膜腫1例.乏突起芽腫2例など）.高悪性度の神経膠腫（以下.グレードIII以上）19例（星細胞腫グレードIII.IV 14例.間脳性髄膜腫2例）であること。 (星細胞腫グレードIIIおよびIV 14例.間葉系脳室性髄膜腫2例.間葉系乏突起芽腫1例.髄芽腫2例など)
高悪性度グリオーマ患者の脳脊髄液中のMMP-2.MMP-9.IL-6の濃度は低悪性度群に比べ有意に高かった。 脳脊髄液中のIL-10濃度は.高悪性度群と低悪性度群で有意な差はなかった。
神経膠腫患者における術後のIL-6.IL-10.MMP-2.MMP-9の経時的変化
この実験で測定された神経膠腫患者の脳脊髄液中のMMP-9のレベルは.術後24時間以内に急速に減少した。MMP-2とIL-10のレベルは.術後の異なる時点において大きな変化はなかった。脳脊髄液中のIL-6のレベルは術後徐々に減少した
ディスカッション
神経膠腫は.中枢神経系に発生する最も一般的な悪性腫瘍で.再発しやすく.何度も手術が必要となる場合が多く.片麻痺.失語症.精神遅滞.精神障害などの重い障害が発生し.家族に計り知れない苦痛と破壊を与える可能性があります。 膠芽腫や間葉系グリオーマなどの高悪性度グリオーマは.びまん性の浸潤性増殖を示し.平均生存期間は1年強とされています。 手術や放射線治療などの従来の治療法は腫瘍を縮小させることに特化しており.腫瘍の再発はほぼ避けられないとされています。 現在.腫瘍の肉眼的切除だけでなく.侵襲性や免疫抑制など.入口となる神経膠腫の生物学の主要な特徴に着目した研究が行われています。神経膠腫の研究では大きな進歩がありましたが.生存期間中央値は9.10週間しか改善していません[2]。 そのため.神経膠腫の発症の分子メカニズムに基づいた新たな治療標的の探索が緊急かつ必要となっています。
神経膠腫患者におけるIL-6およびIL-10の発現とその意義
脳は.血液脳関門が免疫細胞に対して比較的不透過であること.中枢神経系にリンパ系が存在しないこと.中枢神経系におけるミクログリアや内在性マクロファージが比較的不活性であることから.長い間「免疫免疫臓器」とみなされてきました。 中枢神経系における活発な免疫の存在は.特異的免疫療法を用いたより効果的な神経膠腫の治療法開発のための新しい方向性を示すと考えられます。 研究者にとっては.正常な組織を傷つけずに標的の神経膠腫細胞を殺すことができる神経膠腫免疫療法は.より魅力的で有望な研究であると思われます。 しかし.Wheelerらによって行われた最近の第I相および第II相臨床試験では.再発神経膠芽腫患者における樹状細胞ワクチンの安全性にもかかわらず.満足のいく治療結果が得られないことが示されています[3]。 現在.免疫療法や免疫系が腫瘍細胞を標的にできないのは.主に神経膠腫に関連する多くの免疫サイトカインの制御異常によることが知られています。これらのサイトカインは神経膠腫患者の免疫抑制と免疫回避につながり.腫瘍細胞の増殖と血管新生を促進し.腫瘍の攻撃性を高めて腫瘍の進行を促すとともに.様々な治療に対する耐性をもたらすと考えられています。 の許容範囲です。
IL-6とIL-10は.神経膠腫の治療のための新しいターゲットとして注目されています。 近年.高悪性度神経膠腫細胞は低悪性度神経膠腫細胞に比べてこれらのサイトカインを多く分泌し.発現量と腫瘍の悪性度には相関があることが明らかにされている[4]。 我々は.異なる悪性度の神経膠腫患者のCSFにおけるIL-6とIL-10の発現レベルを比較し.また.それらのレベルと悪性度の間に相関を見出した。 最近.Samarasらは.GBMにおけるIL-6の発現が主に腫瘍細胞とマクロファージに限られ.大きな虚血性壊死領域内に位置していることを示す免疫組織化学的染色結果を提供した。
IL-6は.炎症反応.骨代謝.CRP合成.造血など.多くの生理的・病理的プロセスで機能する多面的なサイトカインであり.多くの細胞種から分泌され.様々な標的細胞に作用して細胞の発生.分化.いくつかの疾患に関連する特定遺伝子の誘導を制御しています。 また.IL-6は.グリオーマの発生における主要な内皮細胞増殖促進サイトカインであるVEGFの発現を刺激する可能性がある。
本実験では.実験群と対照群の脳脊髄液中のIL-6濃度をELISA法により測定し.手術前後の異なる時期におけるその変化を求め.統計解析を行った。 その結果.実験群の脳脊髄液中のIL-6濃度は対照群に比べて有意に高く.グリオーマ患者における炎症因子の異常活性化の存在を確認するとともに.グリオーマ患者の生体内に慢性炎症障害がある状態を示唆していることがわかった。 また.神経膠腫の悪性度が異なる患者さんのCSF中のIL-6濃度を比較したところ.神経膠腫の悪性度と正の相関があることがわかりました。 手術後に脳脊髄液のIL-6濃度が徐々に低下するのは.分泌量の減少や異化作用の増加などが考えられるが.神経損傷や修復における炎症性サイトカインの役割についてはまだ議論の余地がある。
現在.グリオーマを含む様々な腫瘍でIL-10の発現が増加していることが確認されています。 いくつかの研究により.IL-10 が良性腫瘍よりも悪性腫瘍で高いレベルで発現していること.IL-10 が in vitro の実験で神経膠腫細胞株の増殖と浸潤を促進し.この効果は用量に関係することが明らかになりました [5]。 彼らは.神経膠腫患者において.IL-10の主な供給源は.腫瘍細胞よりもむしろミクログリアとマクロファージであると結論づけた[6]。 IL-10 が主要組織適合抗原複合体 II (MHC II) レベルのダウンレギュレーションを通じて単球による抗原提示を減少させ.それによって抗原活性化T細胞の増殖と他の炎症性メディエーターの分泌を阻害することが.いくつかの研究で明らかにされています。 しかし.動物モデルでは.IL-10は特定の抗腫瘍免疫反応を増強する。このため.免疫系におけるIL-10の役割について論争が起こっている。 IL-10は免疫抑制剤というより免疫調節剤として抗GBMエフェクターT細胞の生成に非常に重要な役割を果たすことを示すデータがある[7]。
この実験では.ELISA法によりIL-10濃度を測定し.統計的に分析した。 その結果.実験グループの脳脊髄液中のIL-10濃度は対照グループに比べ有意に上昇し.神経膠腫患者における炎症因子の活性化の存在も確認された。 また.異なるグレードの神経膠腫患者の脳脊髄液中のIL-10濃度を比較したが.データに有意差はなく.腫瘍グレード評価の参考指標としては使用できない。神経膠腫患者の手術前後120時間の脳脊髄液中のIL-10の有意変化がないのは.クリアランス効率が低いか徐放性のため.その増加または有意減少の変化が認められなかったか.あるいは.我々の研究所の の時間は短く.次のステップに続く。
神経膠腫患者におけるMMP-9およびMMP-2の発現と意義
MMPSは.細胞外マトリックスや基底膜などの構造物を分解することを主な役割とするプロテアーゼファミリーであり.この酵素機能にはCa2+とZn2+プラズマの関与が必要である。 MMPSの発現は.炎症反応や腫瘍の浸潤・転移など様々な場面で著しく増加し.その発現量やTIMPSなどの抑制因子による制御.MMPS自身の負のフィードバック制御など.MMPSの役割に影響を与える要因は多岐にわたる。
MMP-9とMMP-2はともにマトリックスメタロプロテアーゼファミリーに属するが.同じ神経膠腫患者でもその発現量は大きく異なっている。 この理由の分析では.それぞれの起源が異なることと密接に関係していると思われるが.正確な起源は不明であり.分子量.放出およびクリアランスの速度などの要因も関係していると思われる。 ある研究[8]では.脳虚血再灌流障害後2時間でその発現が有意に上昇することが示されており.このプロテアーゼが内皮細胞間のタイトジャンクションを破壊し.脳微小血管の基底膜を破壊してBBBオープンにつながる可能性が示唆された。 血液脳関門の破綻や脳微小血管の透過性亢進は脳浮腫を引き起こすが.MMP-2やMMP-9が臨床予後と密接に関係していることが推測される。
MMP-9は.MMPファミリーの中で最も分子量の大きい酵素であり.ゼラチン.IV型およびV型コラーゲン.エラスチンなど様々なタンパク質を異化することができる[9]。 今回の実験では.神経膠腫患者の脳脊髄液中のMMP-9の濃度が対照群に比べて有意に高く.高悪性度群のMMP-9の発現量が低悪性度群に比べて有意に高いことを明らかにした。 脳脊髄液中のMMP-9濃度は腫瘍の悪性度の上昇に伴って増加し.MMP-9の発現量は神経膠腫の悪性度と攻撃性及び予後に関する重要な指標となる可能性があると考えられる。
MMP-9の発現に関する研究では.脳脊髄液中の発現が術後に突然減少することが注目されるが.これは試験した他のバイオマーカーでは示されない特徴であり.腫瘍を有する状態の解除に関連していると考えられ.腫瘍細胞自体または腫瘍に刺激された周囲の正常細胞によって産生されている可能性が示唆される。 腫瘍の大きさと相関があるかどうかについては今後の検討が必要であり.もし相関があれば.より臨床的な参考価値を高めることができるだろう。
MMP-2は.MMPファミリーの重要なメンバーであり.内皮細胞と毛細血管壁の基底膜との間のタイトジャンクションの主要構成要素であるエラスチン.ラミニン.フィブロネクチンなどのタンパク質を加水分解します。 これらのタンパク質が破壊されると.基底膜の透過性が高まり.BBB構造が破壊され.脳組織の水腫や頭蓋内圧の上昇などの病的な障害が引き起こされます。
今回の実験では.MMP-2は正常対照群では発現が低く.グリオーマでは有意に増加しており.高悪性度群と低悪性度群の発現の差は統計的に有意であったが.突出したものではなかったことから.グリオーマの侵攻性増殖にはMMP-9がより重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
以上のことから.MMP-9.MMP-2.IL-6.IL-10は神経膠腫の免疫と浸潤に支配的あるいは決定的な役割を担っていると思われる。 神経膠腫患者の脳脊髄液中のIL-10濃度は.高悪性度群と低悪性度群で有意差がなく.神経膠腫の悪性度の参考指標として使用できなかったが.MMP-2.MMP-9.IL-6の発現量は高悪性度群と低悪性度群で有意差があり.神経膠腫腫瘍悪性度の参考指標として使用できることが示された。 神経膠腫患者の脳脊髄液中のMMP-9濃度は.術後24時間以内に有意に低下し.腫瘍の存在状態の解消と関連していると考えられ.患者の臨床予後を予測する生化学的指標として利用可能である。