肝線維症は.肝臓にダメージを与える因子が長期間にわたって刺激された結果.最終的に肝硬変に進展する。 肝線維化の分子メカニズムが解明されるにつれ.肝線維化が可逆的なプロセスであることが次第に受け入れられてきています。 1995年.米国国立衛生研究所（NIH）は.ベクター技術の開発.疾病の分子メカニズムの研究.動物モデルの開発を遺伝子治療研究の正しい方向とすべきであると結論づけた。 本稿では.肝線維化の分子機構と.肝線維化の遺伝子治療におけるベクター技術の応用に焦点を当てます。 1.肝線維化の分子機構に関する遺伝子治療研究 1.1 肝星細胞の制御 肝星細胞（HSC）の活性化と増殖は.肝線維化発症の中心であり.共通の経路である。 活性化した造血幹細胞はα-平滑筋α（α-SMA）とグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現しています。 活性化した造血幹細胞は.I型.III型.IV型コラーゲン.ラミニンなどの線維化過程の様々な細胞外マトリックス（ECM）成分を分泌することができる。また.活性化した造血幹細胞はマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）とその阻害剤マトリックスメタロプロテイナーゼ組織阻害剤を分泌できる また.活性化した造血幹細胞は.マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）とその阻害剤である組織メタロプロテアーゼ阻害剤（TIMP）を分泌し.ECMの分解が相対的に不足して肝臓に過剰に沈着し.肝繊維症を形成することがあります。 したがって.造血幹細胞の活性化および増殖の制御は.肝線維症の遺伝子治療にとって重要なアプローチである。 1.1.1 造血幹細胞の活性化抑制 肝臓における酸化ストレスと炎症反応は.肝線維症発症のイニシエーションリンクであるため.多くの炎症性因子が造血幹細胞を活性化し.肝線維症の発症につながる可能性があります。 Silybum.豆類のホスファチジルコリン.S-アデノシル-L-メチオニンなどの抗酸化物質は.造血幹細胞の活性化を抑制することにより.肝線維化の程度を軽減することが分かっています。 Chenらは.IFN-αが造血幹細胞の活性化を効果的に抑制し.造血幹細胞におけるα-SMAの発現.TIMP-1およびトランスフォーミング増殖因子（TGF-β）のmRNAレベルを低下させることを明らかにした。 その他.トレチノインA.グリチルレチン酸.パルミチン酸レチニル.レスベラトロールなどのサイトカインが造血幹細胞の活性化を抑制することが示されている。 TGF-βは造血幹細胞活性化の最も有効な刺激因子である。 肝損傷時.ECMはTGF-βを放出し.造血幹細胞の活性化を促進するが.造血幹細胞の増殖を抑制し.肝細胞の増殖を抑制し.アポトーシスを誘導する。TGF-βはSmadシグナル経路を通じてコラーゲン合成を促進し.MMP合成を抑制し.TIMP合成を促進する。MMP合成が減少するとECM分解が不十分となりECM蓄積となる。 動物モデルでは.多くの抗TGF-β受容体が有効であることが示されている。 セリンプロテアーゼ阻害剤はTGF-βの活性化をブロックすることができ.Smad-7転移因子はTGF-βの細胞内シグナル伝達経路をブロックする。また.我々の研究では.RNAによってTGF-β伝達経路のSmad-2の発現を妨害すると.造血幹細胞のTGF-β活性化を阻害することが証明されている . Peroxisome proliferator activator receptor gamma（PPAR-γ）は細胞の増殖と分化を制御しており.チアゾリジン系薬剤はPPAR-γリガンドとして造血幹細胞の活性化を抑制し.線維素溶解を促進することが知られています。 カプトプリル（アンジオテンシン変換酵素阻害剤）とカンデサルタン（アンジオテンシンII受容体拮抗剤）も造血幹細胞に作用し.線溶を促進することにより.肝線維化の程度を軽減すると考えられています。 1.1.2 造血幹細胞増殖抑制作用 血小板由来増殖因子（PDGF）.上皮増殖因子（EGF）.線維芽細胞増殖因子.インスリン様増殖因子.血小板由来増殖因子（EGF）.血小板由来増殖因子（PDGF）.線維芽細胞増殖因子（EGF）.インスリン様増殖因子（IGF）。成長因子（IGF-I）は.急性および慢性肝損傷において.チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達経路を介して造血幹細胞の増殖を促進することができます。 PDGFは特に重要であり.ホスホジエステラーゼ阻害剤である3-7-ジメチルキサンチンはPDGFに関連する造血幹細胞の分裂を阻害する。 また.トリニトロフェニル（TNP-470）の抗血管新生作用は造血幹細胞の増殖を抑制することができます。 一方.低分子チロシンキナーゼ受容体阻害剤は.さらに改良を加えて肝線維症の治療に使用されることが期待されます。 1.1.3 造血幹細胞のアポトーシスの誘導 肝線維症の自然な反転は.主に造血幹細胞のアポトーシスに依存しており.造血幹細胞数の減少.ECMの分泌の減少.TIMPの合成の減少.MMPの活性上昇.ECMの分解の増加により.肝線維症の反転を促進させることができます。 死亡受容体経路.ミトコンドリア経路.小胞体経路は造血幹細胞のアポトーシスを媒介する最も重要な経路である。 造血幹細胞は.Fasリガンド.TNF-α.神経成長因子（NGF）など多くの細胞表面死受容体を発現しており.これらは対応する受容体に作用してin vitroで造血幹細胞のアポトーシスを誘導できる。ジアゼパムはミトコンドリア孔の末梢ベンゾジアゼピン受容体（PBR）に作用して.造血幹細胞のアポトーシスを促進し.分岐マイコプロテインとサラゾスルファピリジンは.次のように造血幹細胞のアポトーシスを促進していた。 は.核内転写因子（NF-κB）を阻害し.造血幹細胞のアポトーシスを促進します。 1.2 細胞外マトリックスの分解促進 ECMの合成と分解のアンバランス.マトリックスのリモデリング.I/III型コラーゲンなどの間質性コラーゲン成分の異常な沈着が肝線維化の病態基盤となっています。 したがって.コラゲナーゼの遺伝子発現を増加させ.内因性コラゲナーゼの生物活性を調節し.増加したECMを分解することが肝線維化の過程を逆転させる鍵となるのである。 MMPは.ECMの分解に重要な役割を果たすタンパク質分解酵素群であり.その活性は.組織における特異的阻害剤であるTIMPの発現と密接な関係がある。 現在.MMPやTIMPは肝線維症の遺伝子治療の重要なターゲットとなっており.MMPファミリーには基質に応じて.間葉系コラゲナーゼ.ゼラチナーゼ.メソライシン.膜型MMP（MT-MMP）の4つの主要なグループがあります。 これまでに同定されたTIMPには.TIMP-1.-2.-3.-4があり.いずれも特定の活性型MMPと1：1の複合体で結合し.ECMに対する後者の分解活性を阻害することができる。 肝線維化ラットにMMPを発現するプラスミドやTIMPのアンチセンスオリゴヌクレオチドプラスミドをトランスフェクトすると.I/III型コラーゲンの分解が促進されて線維化が回復すること.生殖ホルモンであるリラキシン（relaxin）もTIMPをダウンレギュレートすることによって造血幹細胞の活性化によるコラーゲン沈着が減少すること.プロリン4水酸化酵素阻害剤はTIMPの働きを阻害して.相対的に プロリン-4-ヒドロキシラーゼの阻害剤は.TIMPを阻害することによりMMPの活性を高め.ECMの分解を促進し.肝線維症を回復させることができます。 ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（uPA）は.ECM切断タンパク質カスケードの開始因子であり.また.肝細胞増殖因子（HGF）の発現を増加させ.MMP活性を上昇させ.肝繊維化の回復と肝細胞再生を促進します。 2.肝線維症の遺伝子治療におけるベクター技術の応用 遺伝子治療では.効果的な遺伝子導入が重要であり.標的細胞でサイトカインの効果を最大限に発揮させるために.適切なベクターを選択することが重要です。 理想的なベクターは.高い特異性.高い親和性.高い遺伝子容量.高い組み込み・トランスフェクション効率.低い抗原性・毒性.機能的遺伝子の長い発現期間といった利点を備えている必要があります。 遺伝子ベクターは.ウイルスベクターと非ウイルスベクターに分類される。 非ウイルス性ベクターとしては.リポソーム封入DNA.ポリプレックス（ポリリジン複合体など）.組換えセリアックレムナントなどがあります。 非ウイルス性ベクターは.遺伝子搭載量が多い.抗原性が低い.毒性が低いなどの利点がありますが.同時に機能性遺伝子の発現効率が低く.発現期間が短いという欠点があるため.現在研究・使用されているベクターの70%以上がウイルス性ベクターとなっています。 現在.遺伝子導入にはウイルスベクターが最も有効な手段と考えられており.レトロウイルス.アデノウイルス.アデノ随伴ウイルス（AAV）が肝線維症の遺伝子治療に最も有望なベクターとされています。 アデノウイルスベクターは2本鎖のDNA分子であり.このことが物理的・化学的安定性を最も重要な特性として決定している。 アデノウイルスベクターは.分裂している細胞にも非分裂の細胞にも感染でき.アデノウイルスによる標的遺伝子産物の発現は治療レベルに達するほど高くすることができる。 Qiらは.内因性TGF-β受容体シグナル伝達経路を遮断するために.TGF-βタイプII受容体の細胞外領域を発現する複製欠損アデノウイルスベクターを構築した。Rederfeldらは.CCl4誘導BALB/cにMMP-9の変異体を導入した マウスにTIMP-1に結合させ.TIMP-1のノックダウンを達成した。Salgadoらは.コラゲナーゼ発現を誘導するために.アデノウイルスによる欠陥のある非分泌型ヒトuPA遺伝子を構築した。 しかし.アデノウイルスベクターは.目的遺伝子の発現期間が短いという欠点があり.また.アデノウイルスは免疫原性があるため.宿主に免疫反応や毒性副作用を引き起こす可能性がある。 AAVは一本鎖の非病原性DNAウイルスで.19番染色体に組み込まれ.ヘルパーウイルスの助けを借りて毒性をもって感染することができる。 AAVは造血幹細胞の活性化を抑制するヒトIFN-γ（hIFN-γ）の発現に用いられており.Tsuiらは門脈注入による肝線維化動物モデルでAAVを介したI型ヘムオキシゲナーゼ遺伝子（HO-1）を用い.満足なトランスフェクション効率と安定発現を得ています。 レトロウイルスはエンベロープを持つRNAウイルスで.ゲノムの構造によって.マウス白血病ウイルス（MLV）のような単純なレトロウイルスと.ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のような複雑なレンチウイルス（LV）属のレトロウイルスに分類される。 HIV）です。 単純なレトロウイルスは.肝線維症の遺伝子治療に初めて使用された。 増殖中の分裂細胞にしか外来遺伝子を導入できず.静止細胞には効果がないため.これまでの著者らは肝細胞の分裂を誘導するために部分肝切除などのダメージを与える手段を用いなければならず.ウイルス粒子の安定性が悪い.保有する外来遺伝子が少ない.相補性による破壊が早いという欠点があり.利用が制限されていた。 レンチウイルスはレトロウイルス科に属するウイルスです。 現在までに分離された主なレンチウイルスは.HIV.トナカイ伝染性貧血ウイルス（EIAV）.サミアン免疫不全ウイルス（SIV）である。 レンチウイルスのゲノムは他のレトロウイルスと異なり複雑で.gag, pol, envの3つの構造遺伝子と5’末端と3’末端のLTR構造.vif, vpr, nef, vpuの4つのヘルパー遺伝子.tatと revという2つの制御遺伝子を含んでいます。 感染・形質転換した動物細胞は連続的に受け継がれるため.レンチウイルスをベクターとして使い.動物細胞の遺伝子型を変化させて子孫に受け継がせることができる。 レンチウイルスベクターの最大の特徴は.非分裂細胞だけでなく分裂細胞にも感染し.宿主で長期間発現させることができ.宿主の免疫反応を誘発しにくく安全性が高いことである。 また.レンチウイルスは.一般的に最大8～10kbとされる強力なパッケージング能力を持つため.複数の遺伝子発現系に適しています。 zahlerらは.初代培養胎児肝細胞においてLVの感染効率が30〜40%に達することを見出した。 LVを改良し.ラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞をin vitroで効率的に形質転換することができた。 我々は.レンチウイルスを介したtTG遺伝子RNA干渉プラスミドを構築し.初代ラット造血幹細胞をトランスフェクトし.安定した発現を得ることができた。 肝細胞への遺伝子導入におけるその良好な特性から.肝線維症の遺伝子治療におけるレンチウイルスベクターの使用はますます注目されており.継続的な改良によりその安全性が徐々に確保されつつあります。 2.2 ベクターのターゲティング 肝臓以外の組織や臓器もターゲットとなりうるため.治療効果の特異性やターゲティングを重視した肝臓特異的ターゲティングベクターの選択が注目されており.作用効率を高めるだけでなく.他の臓器への毒性の可能性を低減させることができます。 稲垣らは.ベクターのプロモーターにエンハンサー配列COL1A2を加えることで.特定のエンハンサーを持つマウスの肝線維化群でのみ.外来遺伝子が発現することを見いだした。 この外来遺伝子は.肝線維化マウスの活性化造血幹細胞にのみ発現し.正常マウスの肝臓や他の臓器では発現していなかった。 したがって.肝線維症遺伝子治療のための肝実質細胞や間葉系細胞に対する高選択的ターゲティングベクターのさらなるスクリーニングは.肝線維症治療のターゲティングと効率を高め.抗肝線維症治療の全体レベルを向上させると考えられます。 結論として.肝線維症の分子メカニズムの理解が進むにつれ.肝線維症の遺伝子治療は発展の見込みがある。同様に.ベクター技術の発展も.肝線維症の遺伝子治療の標的.安全性.有効性を向上させる保証となってきている。 しかし.肝線維化は複数の遺伝子や経路によって制御されており.現在.ほとんどの遺伝子治療は動物実験にとどまっています。 したがって.肝線維症の遺伝子治療の研究には長い道のりがあり.多連結複合遺伝子治療の利用やベクターシステムのターゲティングと安全性のさらなる向上は.肝線維症の遺伝子治療開発にとって重要な方向性である。