グリア系腫瘍は中枢神経系で最も多く見られる腫瘍であり.ヒトでは治療が困難な腫瘍でもある。 グリアブラストーマ（GBM）はその代表的な腫瘍で.腫瘍間および腫瘍内の組織形態が多様で異種であることから.多形グリアブラストーマとも称される。 この20年間で.GBMの不均一性は.その組織学的症状だけでなく.不均一な生物学的挙動（増殖とアポトーシス.血管新生と浸潤性移動）.ひいては不均一な治療反応という観点からも理解されるようになりました[1,2]。 1990年代を通じて.GBMの異質性は腫瘍細胞の遺伝的表現型の変化のみに起因するとされていました。 脳腫瘍幹細胞の発見は.神経腫瘍学研究における重要な出来事であり.GBMの発生様式.腫瘍の不均一性.腫瘍細胞と微小環境の関係.治療戦略に関する我々の科学的研究に大きな影響を与えた[1-3]。
I. 脳腫瘍幹細胞の同定とスクリーニング
急性骨髄性白血病の腫瘍細胞は.実験的移植により約0.01-1％しか誘導できず.これが腫瘍幹細胞の存在を証明する最初の証拠となった[2]。 その後.腫瘍幹細胞は.乳癌.大腸癌.膵臓癌.肺癌などの固形癌にも見いだされた[4]。 腫瘍幹細胞は.グリオーマ.髄芽腫.脳室性髄膜腫.神経芽腫などの高悪性度原発脳腫瘍でも見つかっているが.低悪性度脳腫瘍ではまだ陽性所見はない [5]． 脳腫瘍幹細胞は.自己複製能.無血清培地での細胞球形成能.幹細胞マーカーの発現.多面的分化能など.神経幹細胞と同様の特徴を示す。脳腫瘍幹細胞は.異常分化マーカーの発現.染色体異常.腫瘍形成能を有する点で神経幹細胞とは異なる[5]。 脳腫瘍幹細胞研究の分野で確立され.標準化されるべきものがあるとすれば.それは脳腫瘍幹細胞の同定とスクリーニングであり.脳腫瘍幹細胞の理論体系全体に関わることである。 実際.脳腫瘍幹細胞の研究結果は一貫しておらず.矛盾していることさえある。腫瘍細胞の亜集団の分離と濃縮の方法や手順が異なることが.この大きな理由の一つである。
CD133.A2B5.CD15は明確な生物学的機能が見つかっていない代替マーカーであり.CD171.ITGA6.EGFRは機能的マーカーである[3]。 免疫磁気ビーズソーティングや蛍光活性化セルソーティング（FACS）は.これらの分子マーカーを利用して腫瘍幹細胞を分離しています。
CD133は.造血幹細胞や神経幹細胞の分離に初めて使用され.脳腫瘍幹細胞の同定やソーティングにも広く使用されている[6,7]。 GBMでは.CD133+細胞がNOD-SCIDマウスで頭蓋内増殖し.CD133-細胞と比較して腫瘍形成能があることがわかった[3]。 しかし.異なる結果も報告されており.GBM組織標本またはin vitro培養細胞株のいずれかから単離されたCD133-細胞も腫瘍形成能を有していた[8,9]。 この一貫性のない結果は.方法論の欠陥が原因である可能性がある。 まず.FACS法とは対照的に.免疫磁気ビーズソーティング法は特異性に欠け.得られたCD133+細胞には免疫磁気ビーズに特異的に結合していないCD33-細胞が混在し.CD133+細胞のみが濃縮されていないことが挙げられる[10]。 同様に.「CD133-細胞は腫瘍を形成する」という結論も.ソーティングの際にCD133-細胞とCD133+細胞が混在することが原因である可能性がある[11]。 もちろん.細胞の精製方法を標準化し.厳密にデザインされた内部コントロール実験を行うことで.細胞の交絡を排除することができる。 さらに.神経膠腫間質の内皮細胞はCD133を発現しており.腫瘍組織から分離したCD133+細胞はCD133+内皮細胞を含み.移植モデルにおいてCD133+細胞はCD133-細胞よりも増殖に有利であると考えられる。 しかし.最近の研究では.FACSで精製したCD133+細胞とCD133-細胞の両方が.内皮細胞の影響を除いても.ヌードマウスの腫瘍の成長を促進する能力があることが報告された[11]。 腫瘍幹細胞のソーティングに用いられる抗CD133抗体には.抗CD133/1抗体と抗CD133/2抗体があり.これらはCD133膜貫通タンパク質の異なるグリコシル化エピトープを認識するため.研究間の結果の一貫性に影響を与えることもある[12]。 方法論の欠陥による実験結果の一貫性のなさは.A2B5やCD15といった代替分子マーカーにも見られる[3]。
腫瘍幹細胞の濃縮マーカーとして.また治療標的として機能するマーカーの発見と最適化は.重要な研究方向である。 さらに.神経幹細胞のマーカーであるEGFR（Epidermalgrowthfactorreceptor）[13]が.脳室下帯の神経幹細胞の分裂と幹性維持に関連していることを例に挙げて説明する[14,15]。 分子神経病理学では.以前から.原発性GBMの60％以上でEGFRが発現しているが.二次性GBMでは発現していないことが分かっており.診断や予後への影響が懸念されている。 同じGBM腫瘍標本におけるEGFR+腫瘍細胞の分布は不均一であり.EGFRがGBMにおける細胞亜集団を区別する分子マーカーとして使用できることが示唆された[16]。 ヒトのGBM組織標本と腫瘍幹細胞株からFACSによりGBM細胞亜集団が分離され.その中でEGFR+細胞亜集団は.CD133やCD15との共発現の有無にかかわらず.最も悪性の分子および機能表現型を示した[3]。 腫瘍幹細胞株の細胞におけるEGFRの発現を機能獲得または機能喪失により変化させると.それに対応して細胞増殖が促進または阻害される。 EGFRの発現が神経膠腫の形成に必要であることは明らかであり.神経膠腫細胞亜集団の機能マーカーとしてだけでなく.GBMの治療標的としても使用することができる。 また.EGFR-腫瘍細胞亜集団は移植腫瘍形成中にEGFRの再発現を示すことがあり.幹細胞マーカーの発現制御は動的なプロセスであることが示唆された。 新しい研究では.メラノーマとGBMにおいて腫瘍細胞亜集団の動的な維持が存在することも証明されています[17,18]。
II.神経膠腫における腫瘍形成の理論
複雑な腫瘍細胞構成は.腫瘍細胞の増殖.浸潤.特殊化において常に細胞補充が必要とされ.ダイナミックに変化しており.この過程で生じる腫瘍の不均一性の説明機構として.階層的モデルと確率的モデルの2つがあります。
階層型モデルは.腫瘍の発生と維持には.「幹」細胞.すなわち腫瘍幹細胞の小さな亜集団が必要であるという事実を指している。 腫瘍幹細胞は.制御できない自己複製により無制限に増殖し.無差別に分化する。腫瘍幹細胞から分化した腫瘍細胞の大部分は自己複製能を持たず.腫瘍の不死化には大きな影響を与えない。 腫瘍の不均一性は.腫瘍幹細胞とその分化した子孫細胞の共存によって引き起こされます。 確率論的モデルは.腫瘍内の大部分の細胞が自己複製能力を持ち.腫瘍の形成と維持に寄与するモデルである。 腫瘍の不均一性は.主に腫瘍細胞クローン間の分子遺伝学的およびエピジェネティックな差異に起因している。 さらに重要なことは.確率モデルでは腫瘍内のすべての腫瘍細胞が腫瘍形成能力を有すると仮定しているが.腫瘍形成の過程ではある程度.腫瘍を維持するために細胞のチームワークも必要である。腫瘍内に補充される細胞の表現型の違いは.腫瘍の変形と悪性化の異なる段階に存在する細胞のクローンを反映している [19,20] ことである。
当初.造血器系の悪性腫瘍.乳癌.大腸癌では.腫瘍細胞のごく小さな部分集団が新しい腫瘍を形成する能力を持っていることがいくつかの研究で示され.階層的モデルを強く支持した [21] 。 2007年.kellyらは.3つの異なる原発性造血系腫瘍モデルマウスから分離された細胞の10％以上が.非照射レシピエントマウスに腫瘍を誘発する能力を有していることを見出した[22]。 マウス大腸がんにおける腫瘍形成能[23]。 これに呼応するように.単細胞移植の解析では.ヒトのメラノーマで25％以上の腫瘍形成細胞が発見された。 最近.膠芽腫でも同様の報告がなされています。 実際.造血器腫瘍や.乳癌.大腸癌.膵臓癌.髄芽腫など.発生組織の細胞のグレードが厳密に定義されているいくつかの固形癌には.グレードモデルがより適していると思われる[11,18]。 一方.GBMは神経堤や成熟脳など間葉系に類似した構造を持つ組織を起源とするため.ランダムなパターンと柔軟性の高い腫瘍形成パターンを必要とする可能性がある。 GBMでは.活性な腫瘍形成細胞のグループが複数存在し.それぞれは特異的なマーカータンパク質の発現.異なる機能的表現型や遺伝子の分子特性（浸潤性.血管新生性.増殖性）によって識別することができます。 腫瘍形成のランダムなパターンは.GBMに固有の不均一性を説明するのに.階層的パターンよりも適切かもしれない。しかし.階層的パターンを完全に除外することはできない。 最近.白血病の研究において.階層的モデルとランダムモデルは相互に排他的ではなく.腫瘍細胞の進化は両方のモデルに支配されることが示唆されている[11]。
III.神経膠腫幹細胞の微小環境
腫瘍を微小生態系として理解すれば.異なる細胞クローン間だけでなく.腫瘍細胞と微小環境との関係も存在することになる。 この相乗システムでは.腫瘍細胞クローンが互いに酸素.栄養.空間を奪い合い.より強いものが自然淘汰される。このシステムは.腫瘍細胞と非腫瘍細胞の間に局所的な微小環境を作り.腫瘍の成長.浸潤.アポトーシス.および/または治療抵抗性と免疫回避を促進する。 脳腫瘍の微小環境の構成要素には.ミクログリア.マクロファージ.アストロサイト.オリゴデンドロサイト.ニューロン.グリアおよびニューロン前駆細胞.細胞外マトリックス.周皮細胞および内皮細胞が含まれる [1] 。 GBM細胞が有髄軸索.血管基底膜または脳室下膜に沿って容易に侵入し.腫瘍細胞の侵入移動に対する微小環境の影響が示されている [24]（GBM, 1999）。 腫瘍幹細胞の「幹性」を維持するためには.微小環境における神経膠細胞と内皮細胞との相互作用が重要である[25]。 異種移植モデルにおいて.内皮細胞や血管の増殖は.自己複製細胞集団を拡大し.腫瘍の成長を加速させる可能性があります。 一方.エルロチニブによるEGFRのダウンレギュレーションを標的とした阻害やベバシズマブによるVEGFの直接中和は.腫瘍の成長を抑え.自己再生能力を持つ細胞の数を減少させることができます。
腫瘍幹細胞の維持と生存は.c-Myc.Oct4（POU5F1）.Olig2.Bmi1などの増殖・生存経路による内的な制御と.腫瘍が存在する微小環境またはニッチで生じる成長因子や細胞マトリックスとの相互作用による外的な制御の両方によって行われています [26]． 研究により.腫瘍幹細胞と腫瘍幹細胞が存在する微小環境との相互通信が.GBMの細胞運命に影響を与えることが実証されている[27,28]。 しかし.腫瘍細胞と微小環境の相互作用については.まだ解明には至っていません。 急速に成長するグリオーマでは.腫瘍細胞が自身の微小環境を確立するのか.それとも腫瘍幹細胞を勧誘する微小環境がすでに存在するのか.依然として不明である。 腫瘍細胞と間質との双方向の関係とは？ 腫瘍浸潤の最先端で腫瘍幹細胞はどのような役割を果たし.免疫系とどのように相互作用しているのでしょうか？ 腫瘍幹細胞と微小環境とのコミュニケーション機構を深く研究することは.腫瘍幹細胞の腫瘍形成.成長.維持.浸潤.治療に対する抵抗性に役立ち.悪性グリオーマのより効果的な治療戦略につながると考えられる。
免疫不全マウスは.腫瘍幹細胞のin vivo研究によく使われますが.免疫不全マウスは.腫瘍患者に存在し.細胞グレード形成の重要なドライバーである免疫系の構成要素を複製することができません[5]。 免疫不全の状態は.特定の腫瘍細胞の増殖を許し.また.患者の実態を歪めてしまう可能性があります。 遺伝子工学的に改良されたマウスモデルでは.ホモ接合体の宿主を作り出すことができるが.細胞の異種性が相対的に欠如しており.異なる種の細胞間の因子シグナルの差異が.腫瘍幹細胞研究にとって依然として課題である。 ヒトの条件下での多種多様な分子遺伝学的およびエピジェネティックな変化を完全に表現し.腫瘍幹細胞とそれが存在する微小環境との相互連絡特性を忠実に反映できるモデル系は存在しないことに留意する必要がある。
IV.治療への示唆
分子標的治療薬は.従来の細胞毒性薬よりも毒性が低く効率的であり.既存の治療アプローチを補完すると考えられるが.悪性グリオーマにおける第一世代の標的治療試験の結果は心もとない。 実際.再発悪性グリオーマでは.標的薬剤の単剤治療は成功していません。 腫瘍の増殖細胞亜集団の不均一性が.治療に対する臨床効果の大きな理由の一つであることは明らかである[11,18]。 例えば.EGFR のキナーゼドメインを阻害する低分子チロシンキナーゼ（TK）阻害剤の使用は.GBM の治療戦略となり得るが.これまでに報告されたわずかな臨床試験では.EGFR阻害剤単独では.PTEN 変異のある腫瘍に高レベルのAkt依存性シグナルが存在するため.GBM では部分的にしか効果がないこと［29］.そのような と.同じ腫瘍細胞で複数のTKが共活性化することです[30,31]。 実際.悪性度の高いEGFR+のGBM細胞はTK阻害剤に反応し.同一腫瘍内にEGFR+細胞とEGFR-細胞が共存し.EGFR-細胞の治療に対する非反応が腫瘍の再発を招くことを除けば.EGFRを治療標的として選択することは合理的です [11]． 複数の分子と細胞を同時に標的とするマルチターゲット併用阻害戦略の開発により.治療に対するGBMの一部の細胞亜集団の耐性を克服できると期待されています[3]。
悪性グリオーマの不均一な性質に対応するため.さらなる治療戦略は以下のことを考慮する必要があります。
(1）潜在的な治療標的としてだけでなく.治療反応や予後を予測するために.GBMのさまざまな細胞亜集団.特に機能的なものを選択的に同定できる分子マーカーの探索を継続すること[32]。
(2）バルク臨床腫瘍検体のゲノムおよび転写プロファイリング調査を通じて.悪性グリオーマのタイピングのために遺伝子型と細胞系統発生を組み合わせることは.腫瘍の異なる細胞亜集団間の機能差の理解を容易にするだけでなく.治療のための新しいターゲットを特定することもできる[33]。
(3）最小限の遺伝子タグを用いたGBMの腫瘍細胞亜集団の同定は.患者が特定の標的治療から恩恵を受けるかどうかを前向きに予測し.GBMの個別最適治療を可能にする[13,34-36]。
(4）GBMの効果的な治療戦略は.GBMの異質性は動的なプロセスとみなされるべきで.特定の分子マーカーを持つGBM細胞亜集団にも時間的またはウィンドウ期間があり.バランスのとれた治療戦略と時間順序に従って治療しなければならないことを念頭に置き.GBM「ステージ」のすべてのアクターを考慮する必要があります[3]。 治療ツール[3]。