内皮機能障害は.動脈硬化の初期の病態生理であり.大血管合併症の発症に重要な役割を果たす。酸化ストレスは.動脈硬化の発症メカニズムの一つである。
内皮前駆細胞（EPC）は.骨髄に存在する幹細胞／前駆細胞の一種で.傷ついた内皮に特異的に巣作りし.成熟した内皮細胞へと分化・増殖することができます。 さらに増殖して成熟した内皮細胞に分化し.血管の新生や再内皮化に関与している。
Fadini GPらは.血糖調節障害者とT2DM患者のEPCを調査し.血糖調節障害者.すなわち糖尿病前段階において.すでにEPCの数が減少していることを示し.EPCの減少が糖尿病の自然経過に伴っていることが示唆されました。 博士は.糖尿病前症における心血管危険因子の増加は.高血糖などの代謝異常の併発による内皮障害だけでなく.循環前駆細胞の枯渇による内皮再生障害も関係しており.循環前駆細胞の減少が心血管危険因子の蓄積につながると結論づけた。 酸化ストレスはEPCの減少に影響する因子である。
2型糖尿病は家族的に集合しており.その子どもは糖尿病を発症するリスクが高い。我々の以前の研究では.耐糖能が正常な2型糖尿病患者の子どもには.すでに血管内皮機能不全が存在することが明らかにされている。 この集団ではEPCの数に変化があるのか.酸化ストレスはあるのか.そして両者の関係は？ この分野の研究は少ない。
本研究では.2型糖尿病（T2DM）患者およびその第一度近親者（FDR）において.内皮依存性血管拡張機能（FMD）.循環EPCs.血清酸化物質および抗酸化物質の変化を調べ.T2DMおよびその大血管合併症発症の予防と治療の基礎とするために.これらの間の関係を検討した。
材料と方法
I. 研究対象者
2008年から2009年にかけて外来および入院での糖負荷試験（OGTT）により診断された男性22名.女性18名.年齢（44.78±1.82歳）の2型糖尿病患者計40名を糖尿病群として選定した。
2型糖尿病患者の子供をFDR群とし.男性20名.女性18名.年齢46.87±1.91歳.空腹時血糖値異常.耐糖能異常.糖尿病を除く38名.正常対照群30名.男性17名.女性13名.年齢44.07±1.89歳.糖尿病の家族歴なしを対象とした。 心電図.超音波検査.血液.尿.便の検査が正常範囲にあり.高血圧.冠動脈疾患.脳血管疾患.末梢血管疾患を除外し.肝機能障害.腎機能障害がなく.体の代謝に影響を与える薬物の服用.インスリン治療が除外された被験者が対象となった。
II. 方法
1.血液生化学的指標の測定：グルコースはグルコースオキシダーゼ法で.HBAlcは化学法で測定した；血中脂質（コレステロール.トリグリセリド）はアメリカBeckman L20自動生化学装置を用いて酵素法で測定した；スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）.マロンアルデヒド（MDA）.グルタチオンパーオキシダーゼ（GSH-FX）.総合抗酸化力（←クリックすると拡大します。 TAO-C)を比色法で測定し.キットはNanjing Jiancheng Institute of Biological Engineeringから購入したものである。 インスリンの定量は.化学発光法により行った。
2.インスリン感受性および膵島B細胞機能関連指数は.以下の式で算出した。
定常状態モデルインスリン抵抗性指数（HOMA-IR）＝（FPG×FIns）／22.5。
3.末梢血EPCカウント：末梢血2mLを採取し.各フロースルーアッセイチューブに全血150ulを加え.一次抗体10ulを加え.アイソタイプコントロールチューブにバッファー10ulを加えてください。 優しく混ぜる。室温で30分インキュベートした後.各チューブに赤血球ライセート2mlを加え.よく混合し.光を避けて室温で10分インキュベートする。 細胞を2mlのバッファーで1回洗浄し.500ulのバッファーに再懸濁し.流量計で検出した。
CD34+KDR+細胞はEPCと同定した（キットはInvitrogenおよびR&Dから購入）。 FACS Calibur analyser (BD, USA) を用いて1×105個の細胞を分析・計数し.データをソフトウェア (Macintosh CELLQuest; BD Biosciences) を用いて処理した。
4.内皮依存性血管内皮機能（FMD）の測定：二次元超音波画像走査法（PHILIPS HDI 5000, General Motors, USA）で測定：患者を平臥位にさせ.血圧計カフを右前腕に結び.収縮期血圧より50mmHgまで膨らませて.5分後に収縮させ反応性鬱血を起こし.上腕動脈画像を30～90秒以内に取得して合成する。 拡張末期内径（Dd1）を30～90秒以内に測定し.心電図と組み合わせた。 反応性うっ血後の上腕動脈内径の変化率（FMD％）＝（Dd1-Dd）/Dd×100％である。
III.統計処理
解析には統計解析パッケージのSPSS 13.0を使用した。 すべての測定データは平均値±標準偏差で表し.測定結果は正規性とカイ二乗の検定を行った。 測定データの多群間比較には一元配置分散分析を.群間の二元配置比較にはSNK-q検定を使用し.P<0.05を有意差とみなした。 変数の相関には.線形相関分析および重回帰分析を使用した。
RESULTS
1.3群の臨床的・生化学的特徴
表1からわかるように.3つのグループは年齢と性別が一致しており.3つのグループ間のBMIに有意差はなかった。 FPGとHbA1cは.T2DM群がControl群とFDRs群に比べ有意に高かったが（P<0.05）.Control群とFDRs群の間には有意差はなかった（P>0.05）。 TC値はT2DM群がFDRs群とNC群に比べ高値を示した（P<0.05）。TGは3群で有意差は認められなかった。 HOMA-IRは対照群.FDR群.T2DM群で徐々に増加し.有意差が認められた（P<0.05）。
2.酸化ストレス指標とアディポカインの3群間比較
表2からわかるように.血清SOD.TAO-C.GSH-PX値はT2DM群で対照群およびFDR群より有意に低かったが（P<0.01）.FDR群と対照群との間には統計的差異はなかった；血清MDA値は対照群.FDR群.T2DM群で徐々に増加した（P<0.01）。
3.3群における内皮機能に関する各種パラメーターの比較
表3からわかるように.EPCとFMDはコントロール.FDR.T2DMの各グループで徐々に減少し.その差は統計的に有意だった（P<0.05）。
ディスカッション
EPCは骨髄.臍帯血.胎児肝臓に由来し.造血前駆細胞マーカーであるCD34.CD133.血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）（キナーゼとも呼ばれる）を発現する。 機能領域受容体（KDR）または胎児肝キナーゼ-1（FLK-1）］やCD31などの内皮マーカーがあります。
EPCはin vitroで分離・培養し.そのアイデンティティと機能を決定することができます。 しかし.高価であるため.大規模な臨床研究に用いることはできない。 したがって.前駆細胞を同定するためのフローサイトメトリーによる表面抗原の解析は.ゴールドスタンダードと考えられている。 CD34は造血幹細胞の重要なマーカーである一方.KDRは血管系の最も初期の細胞マーカーで.胚性血液の血管新生の重要な受容体であり.血管系EPCの重要な分子マーカーとしても使用されている。
正常な状態では.EPCの数は比較的少ないのですが.血管損傷や組織虚血の場合.骨髄に存在するEPCは局所的に放出される成長因子やサイトカインに反応して末梢循環に移動し.損傷や虚血の部位に特異的にホーミングされることが可能です。 さらに増殖して成熟した内皮細胞に分化し.血管の新生と再内皮化に関与している。
内皮前駆細胞がダメージを受けると.内皮の損傷と修復のバランスが崩れ.内皮層の健全性が損なわれ.粥腫病変が発生する。 また.EPCは成長因子を分泌して血管内の成熟内皮細胞を活性化し.内皮の正常な機能を維持します。
つまり.骨髄や末梢血中のEPCの数や機能が損傷した血管の内皮修復の程度を決定するため.EPCは様々な循環器疾患や損傷した血管の治療において重要な生化学的因子と考えられているのです。
糖尿病は心血管疾患の等価リスクであり.2型糖尿病は心血管疾患の高い発生率と死亡率に関連している。 本研究では.FDRとT2DMではEPCの数が対照群と比較して有意に減少しており.FMDも有意に減少していたことから.耐糖能正常の糖尿病患者の第一度近親者には.EPCの減少と血管内皮機能の低下が既に存在していることが示唆されました。
酸化ストレス（OS）とは.虚血.低酸素.高血糖などのストレス環境下において.体内で活性酸素（ROS）や活性窒素（RNS）が過剰に生成され.かつ／または体内の抗酸化力が低下することにより.反応分子の除去能力が低下し.酸化システムと抗酸化システムのバランスが崩れ.組織内の酸素ラジカルレベルが上昇して組織障害またはその可能性を引き起こす病的プロセスのことを指す。 抗酸化酵素
抗酸化酵素には.スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）.カタラーゼ（CAT）.GSH-PXなどがあり.TAO-Cは細胞内の酵素的および非酵素的抗酸化物質の総合レベルを表しています。 酸化ストレスは糖尿病性血管合併症を引き起こすメカニズムの一つであり.GPx-1およびMnSOD活性の低下は.現在.冠動脈疾患患者における心血管イベントの独立した危険因子であると考えられている。
本研究の結果.血清SOD .TAO-C.GSH-PX値はT2DM群ではNC群.FDRs群に比べ有意に低く.血清MDA値はFDRsとT2DMで有意に高く.T2Dの第一近親者で耐糖能異常が既に存在し.酸化・抗酸化系のアンバランスが示唆されたことは過去の報告と同様である [8]．
ピアソン相関解析の結果.FDRにおいて.IRはMDAと正の相関を示し.SOD.TAO-C.GSHと負の相関を示したことから.糖尿病の第一度近親者において酸化ストレスがIRと密接に関連していることが示唆された。 T2DM患者の正常な無血糖の第一度近親者では.インスリン抵抗性と筋細胞の細胞内脂質の増加が.骨格筋のミトコンドリア機能障害による酸化ストレスを呈することが示されており[9].IRは生体の細胞レベルでの過剰な活性酸素に対する生理的防御機構であることが分かっています。
他の組織細胞に比べ.β細胞はフリーラジカル消去酵素（抗酸化酵素）やチオレドキシンなどの活性酸素消去タンパク質が少ないため.生きた活性酸素に極めて敏感で.酸化ストレスによる攻撃に最も弱い。したがって.内因性の抗酸化システムが十分に補われないと.身体は酸化還元不均衡に陥り.ストレス感受性のシグナル経路が活性化されてβ細胞の機能不全とさらに深刻な状態に陥ることになる IRは.最終的にT2DMとその慢性合併症の発症につながる。
このことから.酸化ストレスは遺伝的要因と環境的要因によって発生し.両者は互いに促進し合い.さらにインスリン抵抗性とβ細胞不全を引き起こし.糖尿病とその合併症の発症・進展を誘導すると推測されます。
EPCを従属変数とした重回帰分析では.TOA.MDA.GSH-PX.FBG.HbA1cが式に入り（R=0.979.P<0.05）.統計的に有意差があり.血糖値や酸化ストレスがEPCに影響を与える要因であることが示された。
高血糖とその代謝物は.EPCと血管内皮機能に様々な形で影響を与え.それを通じて血管合併症を引き起こす。
(1) 高グルコースとTNF-αは.EPCのp38-MAPKを活性化することにより.EPCの数を減少させる。
(2) 高グルコースは.FoxO転写因子のリン酸化/アセチル化の不均衡を媒介し.FoxOタンパク質の発現を増加させ.プロアポトーシス遺伝子発現をアップレギュレートし.EPCのアポトーシスを媒介すると考えられる。 FoxOは.さらにEPCの機能を低下させる。
(3）高グルコースは.EPCから放出されるNOの生物学的利用能の低下.あるいはeNOSの補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（BH4）の減少をもたらし.eNOSの結合が解除されてスーパーオキシド負イオン（O-）が発生.活性酸素種クラスター（ROS）が蓄積し.EPCの数や移動能をさらに低下させます。
(4) 高血糖は.EPCの機能を損ない.微粒子（MP）を放出することで血管内皮機能に影響を及ぼします。MPは.外因性凝固経路の開始や血小板とのポリマー形成により血栓やフィブリン形成を促進し.好中球の活性化や単球・内皮細胞の結合促進.好中球への化学走性.炎症反応への関与が期待できます。
酸化ストレスは.EPCの死滅の制御を促進することで.EPCの機能と数に影響を与える。HMG2CoA還元酵素阻害剤スタチンは.PI3/Aktシグナル経路を通じてフォークヘッド転写因子を不活性化し.Bimの発現レベルを低下させることにより.酸化ストレス誘発性アポトーシスからEPCを保護します。
酸化ストレスは.ROS-p53-Bax経路を通じてEPCのアポトーシスを引き起こすこともあり[14].EPCのテロメラーゼの不活性化を誘導し.その老化を促進し制御します。 Ericの研究では.マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）を導入したEPCの適用により.糖尿病マウスの創傷肢の治癒が促進されたことも報告されている。
以上のことから.本研究は.耐糖能が正常な2型糖尿病の第一度近親者に.インスリン抵抗性.酸化ストレス.内皮前駆細胞数の減少.血管内皮機能の低下がすでに存在し.酸化ストレスが糖尿病とその血管合併症のイニシエーションファクターとなる可能性を示唆する。