I. 大腸癌の肝転移の概要
肝臓は大腸癌の転移先として最も多い臓器である。米国では毎年約15万人の大腸がんが新たに発見され.その1/4〜1/3が進行期.すなわちTNMステージのIV期に属していると報告されている。1990年.米国癌学会によると.この年に大腸癌で死亡した人は61,000人で.そのうち4万人近くが肝転移で死亡しています。
初診時.約10％がDukeのステージA.20〜30％がステージB.30〜40％がステージCで.残りは転移患者であった。転移臓器は肝臓が最も多い。大腸がんの初診時に約60％の患者さんが転移を有しています。原発巣の外科的切除後5年以内に.50％の患者さんに肝転移が起こり得ます。死亡後の剖検では.大腸癌症例の 36-81%に肝転移が起こりうることが報告されている[3]。この高い発生率は.大腸癌の全体的な治療水準に影響を与える重要な要因であると考えられる。
大腸癌肝転移の無治療での自然生存期間については.一般に短く.平均生存期間は6～10ヶ月.中央値は4.5.6.6ヶ月であり.6ヶ月生存率0という例さえ報告されている[1]。上記の状況は.大腸癌の肝転移は積極的に治療しなければ予後不良であり.大腸癌の主な死因の一つであることを十分物語っています。
肝転移の大きさが過大であること.大血管と密接な関係があること.肝臓に複数の転移があることなどから.残念ながら診断時に外科的治療に適しているのは肝転移患者の約20%に過ぎません[4]。現状では.手術手技の向上だけでは外科的切除率の向上は困難と思われます。肝転移の存在を早期に発見してこそ.早期の治療が可能となり.生存率の向上と予後の改善が期待できるのです。
大腸癌の肝転移形成のメカニズム
大腸がんの肝転移の形成は.腫瘍細胞と宿主の間で複数の因子が関与する複雑な過程です。その転移の主なプロセスは以下の通りである。
1.細胞外マトリックスへの侵入 原発巣の部位では.がん細胞間の接着力が低下し.がん細胞表面の電荷密度が高まり.相互反発力が高まり.細胞が動きやすくなり.腫瘍細胞が分泌する各種酵素（セリンプロテアーゼやマトリックスメタロプロテアーゼなど）が細胞外マトリックスを消化して基底膜に接着・結合しやすくなり.結果として腫瘍細胞が結合組織で形成するバリアを突き破り.腫瘍細胞が動きやすくなっています。
2.門脈系への侵入 がん細胞は基底膜や血管内皮細胞に接着し.血管内皮の細胞骨格に影響を与え.細胞間隙が増大する。マトリックスメタロプロテアーゼ.ヘパリナーゼ.サイトカイニン.エラスターゼ.ウロキナーゼの作用で.がん細胞は血管内皮と基底膜を越えて門脈系に侵入する。
3.がん細胞は循環の中で生き残る 血液に入ったがん細胞のほとんどは宿主によって殺され.一部は休眠状態にある。転移能の高い細胞の小さな亜集団は.血管内皮に付着して血管壁を貫通し.転移巣を形成することが可能である。
4.肝臓でのがん細胞の増殖 がん細胞が血管を貫通した後.新たな微小環境で増殖できるかどうかが.最終的に転移巣を形成するかどうかの鍵となる。がん細胞は.適切な肝内微小環境条件下で微小血管を透過して増殖した場合にのみ肝転移を形成することができる[7]。
大腸癌の肝転移の形成は.癌細胞の生物学的特性.身体の免疫状態.肝臓の微小環境と関連しています。CRC 肝転移の形成は.簡単に表現すると.原発性大腸癌-門脈路血液-肝臓-肝静脈から肺循環に入り全身へ（または胆汁へ）転移する。
III. 大腸癌肝転移に関連する分子マーカー
浸潤・転移には.腫瘍細胞と宿主細胞や細胞外マトリックスとの接着刺激.腫瘍細胞の基底膜などの宿主バリアに対するタンパク加水分解.腫瘍細胞の方向転換.標的臓器内でのクローン成長など.いくつかのタンパクの関与が必要である。
(I)細胞接着関連受容体の変化
1. カルモジュリン-リガンド蛋白系：β-カドヘリン（β-catenin）は細胞骨格蛋白で.カルモジュリンのC末端（E-cadherin）に結合し.N末端がα-cadherin（α-cat）に結合してE-cad/β-cat/α-cat複合体を形成し.α-catによりアクチンフィラメントに結合する [8]- [8]。E-cad/β-cat/α-cat 複合体は.上皮細胞の極性.形態.組織学的完全性を維持する主要な接着分子である。複合体の機能が失われると.腫瘍細胞間の接着が低下し.容易に剥離し.周辺組織へ侵入する。大腸がんでは.β-カテニンの欠失が肝転移と関連していることが示されている[9]。
Carcinoembryonic antigen (CEA)。CEA は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する高グリコシル化細胞表面糖タンパク質で.腫瘍細胞の接着分子であり.大腸癌の再発・転移に重要な役割を果たします。大腸癌の肝転移の早期発見に最も広く用いられている[10]。CEA 受容体は肝クッパー細胞に存在し.クッパー細胞からサイトカイン（IL-1α.IL-1β.IL-6.TNFα）分泌を誘導する。肝類洞内皮細胞による細胞間接着分子の発現を誘導し.腫瘍の肝内への接着・滞留を増加させます[11]。
3. CD44: 腫瘍細胞表面の接着因子CD44は.内皮細胞への接着を媒介する膜貫通型ヒアルロン酸受容体である。CD44のスプライスバリアントは.血管内皮細胞や細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の接着を促進し.間質への腫瘍細胞の浸潤を促進し.腫瘍細胞骨格タンパク質の凝集と分布に影響を与えることにより.腫瘍細胞の移動と運動に影響を与える可能性があり.いくつかの側面の組み合わせが腫瘍転移の形成に影響を与える [14]．CD44バリアントを発現する腫瘍細胞は.転移の過程で宿主免疫系による認識を回避し.クリアランスから免れることができる。
インテグリン：主に細胞の細胞外マトリックス（ECM）への接着を仲介し.細胞内骨格と細胞外マトリックスの一体化を可能にし.細胞間の接着にも関与する分子である。Takamura Hらは.免疫組織化学的アッセイにより.肝転移を有する大腸がん組織の58％（11/19）にインテグリンαVLA3の陽性染色を認め.非転移組織（0％）に比べて有意に高いことを示した。integrin α3β1の増加は.大腸癌の肝転移に重要な役割を果たす可能性を示唆している。
5, シアリル化ルイスオリゴ糖-X（sLex）抗原： SLXは.肝血管内皮細胞表面のE-セレクチンの受容体として.endothelial leucocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) のリガンドでもある。ELAM-1のリガンドは.大腸癌の肝転移に重要な働きをしていると考えられている。sLex抗原を高発現した腫瘍細胞は.原発巣から脱落して血管系に入り.肝血管内皮に接着して増殖し.肝転移を形成する。このとき.基底膜に浸潤し.活性化したヒト血管内皮細胞に接着し.肝転移を形成しやすくなる。大腸がんの転移巣におけるsLex抗原の発現は.原発巣におけるsLex抗原の発現よりも強いことが研究により確認されています[18,19]。
腫瘍関連抗原である CA 19-9 と sLex は.大腸全域で発現している。これらの糖鎖抗原は.大腸癌が非転移性から転移性腫瘍へと進展するにつれて上昇し.sLexは転移傾向のある大腸癌細胞に共通する特徴である。血清抗原に関連するある種の抗原も腫瘍の進行と関連している。CA19-9抗原レベルは腺腫や大腸癌では正常粘膜に比べ有意に高い。乳糖結合レクチンやガラクトース結合レクチン-3（ガレクチン-3）のような他のレクチンもまた.腫瘍形成や転移進化と関連している[20, 21]。
(ii) プロテアーゼの変化
腫瘍細胞は基底膜や細胞外マトリックスから剥離し.細胞内プロテアーゼが基底膜や細胞外マトリックスを分解してリンパ管や血管に浸潤し.浸潤・転移を構成する。細胞外マトリックス（ECM）分解プロテアーゼには.セリンプロテアーゼ.メタロプロテアーゼ.エラスターゼ.システインプロテアーゼがある。その中でもメタロプロテアーゼファミリー（MMPs）は最も重要なプロテアーゼ群であり.抗腫瘍転移の重要な標的であると考えられている。大腸がんにおいて最も研究されているのは.マトリックスメタロプロテアーゼとウロキナーゼなどである。
1. マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP） MMP は.金属依存性のエンドペプチダーゼで.ECM の様々な成分に対してプロテアーゼ活性を持つ。組織メタロプロテアーゼ阻害剤（TIMP）と膜型マトリックスメタロプロテアーゼ（MT-MMP）により制御されている。
MMPは.コラゲナーゼ（またはゼラチナーゼ）.ストロメライシン.マトリライシン.MT-MMTのグループに分けられる。最も重要なコラゲナーゼはMMP-2と-9で.ECMからコラーゲンを加水分解する。正常結腸組織におけるMMPは.血管内の好中球と集散リンパ節のマクロファージにのみ存在する。MMP-2.-9の量は癌で多く.Dukes病期と相関がある。
2. プラスミノーゲンアクチベーター DeBruin らは.正常大腸粘膜ではウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）活性は低く.組織型プラスミノーゲンアクチベーター（TTPA）活性は低いことを示した。タイププラスミノーゲンアクチベーター（tPA）活性は高いが.大腸癌ではその逆で.大腸腺腫の活動は中間にあることが分かった。
uPAの発現レベルは予後と負の相関があり.uPAタンパク質のレベルは腫瘍の血管新生と有意な相関があることが示されている。Urokinase-type fibrinolytic activator receptor (uPA receptor, uPAR) は.胃癌.膵臓癌.大腸癌などのヒト消化器系腫瘍で高発現しているが.uPARの発現と大腸腫瘍形成との関連はまだ完全に解明されてはいない。ウロキナーゼ型線溶酵素活性化因子（uPA阻害剤.PAI）腫瘍におけるPAI-1のレベルは.予後と負の相関があります。
3, II型セリンプロテアーゼST14/SNC19は.1993年に大腸癌の減数分裂ライブラリーから.転移と関連する細胞外マトリックスを分解する能力を持つものがスクリーニングされました。また.その作用基質が.腫瘍の接着.移動.浸潤.血管伸長に関連するuPAとHGF/SF前駆体（BC-uPAとPro-HGF/SF）であることが確認された。大腸癌の研究では.傍癌粘膜にST14/SNC19が高発現しているものでは.リンパ節転移が高いことが分かっています。
マイクロアレイ技術を応用し.RKO細胞にST14を導入する前後で比較したところ.26個の転移関連遺伝子が異なって発現していることが分かった。そのうち15個が転移促進遺伝子で.11個が腫瘍細胞の転移を抑制する遺伝子であった。転移促進遺伝子は.成長因子.細胞接着因子.転移関連プロテアーゼクラス.シグナル伝達分子.癌遺伝子などの発現が増加した。
一方.転移を抑制する遺伝子（MaspinやTIMP2など）の発現は減少していた。これらの遺伝子の変化は.いずれも細胞の転移を促進することにつながると考えられる。しかし.発現が低下した遺伝子のうち5つは転移促進遺伝子.発現が上昇した遺伝子のうち7つは転移抑制遺伝子であり.一方で転移能が低下している可能性も考えられた。これらが転移に及ぼす影響については.今後の研究により確認する必要がある。ST14 を高発現させると.共焦点顕微鏡で細胞遊走能.浸潤能が上昇し.ECM 分解が促進され.骨格タンパク質 F-actin の脱分極が見られた。このような変化は.遺伝子マイクロアレイアッセイによる高スルーでも確認された。
SNC19トランスフェクション発現後に発現が有意に上昇した遺伝子は以下の通りであった。BRMS1.CSAP8.カベオリン-1.CSF1.C-ETS2.ETV4.HPSE.IGF2.KISS1.MGAT5..CSAP9.H-Ras.ICAM5.KAI1.MMP15.MMP16.MUC1.PIK3.PAI2.TGFA。PAI2.TGFA。
SNC19トランスフェクション発現後に発現が有意に低下した遺伝子は.MMP3.MMP7.Maspin.BCSG1.Osteopontin.およびTIMP-2であった。
4. Maspinは.セリンプロテアーゼインヒビタースーパーファミリーのメンバーであり.1994年にZouらによって.正常乳房上皮と乳癌の間のmeiotic hybridizationとdifferential display deep Lsによって取得されました。浙江大学腫瘍研究所では.胃癌.膵臓癌.大腸癌のペア検体でマスピンの発現が増加していることをmRNA differential display analysisの手法で明らかにした。遺伝子マイクロアレイ研究の応用では.大腸がんと正常粘膜組織のペア検体21組を検査することで.大腸がん16例でマスピンの発現が有意に上昇していることも明らかになった。大腸がんCOLO205細胞株にアンチセンスmaspinを導入したところ.大腸がん細胞の凝集の増加.接着の促進.不規則な形態という形態的変化が見られた。この研究により.Maspin遺伝子が大腸がん転移と関連していることが示されたが.その具体的な作用機序については.まださらなる解明が必要である。
5.他のプロテアーゼやプロテアーゼ阻害剤の発現の変化 ヒストン・プロテアーゼD（カテプシンD）の発現は.がん細胞の浸潤に影響を与える。分泌されるヒストンプロテアーゼは.主に線維芽細胞などの間質細胞由来である。大腸がんにおいても.ヒストンDは悪性細胞に発現しているが.その発現量には大きなばらつきがあり.予後との関係は不明である。
(iii) 血管成長因子
これには相乗効果がある。これらの因子は.オートクラインマスト刺激やパラクライン分泌によっても腫瘍細胞の増殖を促すことができる。腫瘍の増殖には豊富な血液供給が必要であるため.様々な血管成長因子の産生は.腫瘍の急速な増殖と浸潤成長にとって明らかに重要である。 b) 血管内皮細胞の増殖と他の毛細血管形成因子の産生を刺激する。 b-FGF と TGF-b, a (TGF-b と a 大腸がん細胞は angiogenin [25]/) 基本線維芽細胞成長因子 (b-FGF) [25], トランスフォーミング成長因子 (transformation growth factor)
約100年前.腫瘍の血液供給は.腫瘍細胞によって誘導されたかどうかにかかわらず.周囲の正常組織よりもはるかに豊富であることが明らかにされた。1971年 フォークマンは.腫瘍の成長は血液供給に依存しており.血流.酸素.栄養素がなければ.腫瘍は静止状態となり.2-3 mm3の大きさのまま.アポトーシスを起こすと提唱した[26]。血管成長因子には一連のファミリーがあり.腫瘍細胞の表面には血管成長因子関連受容体（VEGFR）が存在する。この膜貫通型受容体がリガンドであるVEGFに結合するとチロシンキナーゼ（TK）が活性化され.血管内皮または/およびリンパ管内皮の増殖につながる。
VEGFファミリーのうち.VEGF Aは血管増殖の主要なメディエーターであり.VEGF B.C.D.Eと関連し.それぞれVEGFR1.2.3.胎盤成長因子（PIGF）が関連している。リンパ管内皮細胞は
VEGFは内皮細胞の増殖を促進するだけでなく.内皮細胞の遊走を制御し.血管透過性を高め.免疫反応を調節して.血管リンパ管の増殖を制御することができる。血管内皮細胞は.腫瘍の発生.浸潤.転移に関与しているらしい。
(IV) その他の転移関連分子
nm23遺伝子は.Steegにより.転移能の異なるマウスメラノーマ細胞株から単離された。nm23は.セリンリン酸化の過程を経て細胞増殖を制御していると考えられる。中でもnm23-H1アイソフォームは腫瘍の転移とより密接な関係があるとされている[27]。ヒトの相同遺伝子nm23-HIも染色体17q21に局在しており.このバンドは大腸癌でしばしばヘテロ接合で失われる。ヒト大腸がんでは.nm23-H1遺伝子のLOHが大腸がんの悪性進行の後期イベントであり.大腸がんの重度の攻撃的挙動と密接に関連していることが観察されており.nm23-H1遺伝子がヒト大腸がんの悪性進行および転移過程の制御に関与している可能性が示唆されている[28]。しかし.研究が進むにつれて.反対の結論も出てきている[29]。
2, PRL3遺伝子 Vogelsteinたちは.serial analysis of gene expression (SAGE.) を用いて.12個の大腸がんすべてで高発現している再生肝転移のホスファターゼ.PRL-3 (phosphatase of regenerating liver-3, 別名 PTP4A3Protein tyrosine phosphatase type IVA3) を発見したが.同じ個人のマッチした原発腫瘍では発現していなかった。これは.イソプレニル化ホスファターゼの新しいクラスに属します[30]。
3. 骨橋タンパク質（OPN） OPNは分泌型糖鎖リンタンパク質で.骨組織のミネラル化に密接に関係しているだけでなく.Ca2+.NOなどの細胞内メッセンジャー.マクロファージの走化性反応.平滑筋細胞の増殖.腫瘍の転移・感染など様々な生理・病態現象に関係し.新しい細胞シグナル分子として考えられている[31]。大腸がんの肝転移組織では.原発巣と比較して OPN の発現が有意に高いことが示されており [32].そのリガンド・レセプター相互作用は大腸がんの肝転移促進に重要な役割を果たすと考えられています。Ding Ling らは.オステオポンチンを発現する腫瘍細胞は.均一な接着が減少し.元の腫瘍塊から容易に剥離することを示しました。一方.血管内皮細胞間の接着が増加するなど.不均一な接着能力が増加し.転移部位に容易に接着することが示された。免疫組織化学的観察から.腫瘍組織とその周囲の肝組織は陽性に着色しており.これは肝細胞におけるその受容体CD44とインテグリンの存在に関連していると思われる。
Rasタンパク質は主に細胞増殖とシグナル伝達に関与し.Rabタンパク質は細胞内膜交通の制御に関与し.Rhoタンパク質（Rasと30％の相同性）は細胞骨格ネットワークの構成に調節的な役割を果たす。Rhoタンパク質（Rasと30％の相同性）は.細胞骨格ネットワークの構成において制御的な役割を果たし.その結果.細胞の形態に影響を与える[33]。Rhoタンパク質の過剰発現が大腸癌の肝転移で検出されることが示されている[34]。Ki-ras コドン 12 の欠損と大腸癌の肝転移能は密接に関連していることが明らかにされた[35]。
大腸癌の肝転移に関連する遺伝子や関連する分子事象は.研究者のたゆまぬ努力により.さらに明らかにされつつある。Vogelstein らは.何百もの腫瘍関連遺伝子が小さな「ノード」とそのネットワークで互いにリンクしていることを示唆した[45]。肝転移の発生には.いくつかの遺伝子やタンパク質の相乗的または拮抗的な作用が必要であり.いくつかの研究の結果が一貫していないことが.研究作業に混乱を招いている。
V. 大腸がん肝転移の分子生物学とバイオインフォマティクス
ゲノムレベル.転写レベル.タンパク質発現レベルをシステムとして研究し.生命システム全体をより大きく.より深く理解するシステム生物学の視点を適用する科学者がますます増えています。浙江大学腫瘍研究所では.大腸がんの肝転移について.染色体コピー数変異データを統合し.表現型ごとの遺伝子発現プロファイルの違いを解析し.染色体の特定セグメントに含まれる遺伝子の発現を研究しました。そして.以下の研究を実施しました。
(1) ヒト原発大腸がん50例のCGH解析において.7つの染色体増幅領域と6つの染色体欠失領域が確認されたが.そのうち16qの高頻度欠失は同様に報告されていない。この16q20-21領域をバイオインフォマティクスで解析し.肝転移に関連する遺伝子を探し出し.さらにバイオテクノロジー的手法で一つ一つ検証し.比較的全体的な情報を得ることができた。
(2) AFFYMETRIX社のHG-U95Aマイクロアレイを適用し.大腸がん組織13例と大腸がん肝転移12例の全ゲノム発現プロファイルを解析し.対応する正常大腸粘膜組織9例をコントロールとして使用した。同じスクリーニング統計アルゴリズムと同じ分類法を用いた場合.染色体コピー数変異データと遺伝子マイクロアレーデータを統合することで.腫瘍分類精度を36%から95%に大幅に改善し.大腸癌の肝転移関連遺伝子群を得ることができた。