215007 蘇州市第五人民病院肝疾患研究所（Tong Fuyi Wu Jianhong Cao Wengui Wu Xingfu Fei Xiaofeng Ding Longqi)
[要旨】 目的 B型肝炎ウイルスマーカー（HBV-M）とHBV負荷（HBV-DNA）の関係を調査し，適切な臨床診断と治療のための科学的根拠を提供することである．方法：患者670名の血清中のHBV-MおよびHBV-DNAをそれぞれ免疫発光法および蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応法で検出した。 結果 HBeAg陽性モードHBV-DNA > 5.0e4 cps/mlが96.3%（363/377）を占め.HBeAg陰性モードHBV-DNA > 5.0e4 cps/mlがHBV-DNA量を占め.HBe抗原陽性パターンがHBe抗原陰性パターンに比べ有意に高率だった（P < 0.05 ）。HBV-DNA量は，1，3，5パターンで1，4，5パターンに比べて有意に高かった（P < 0.01）．18.8%（12/64），Anti-HBs 陽性パターンでは HBV-DNA >5.0e4 cps/ml が 16.7%（7/42） を占めた．結論 HBV-DNA量は，HBe抗原陽性パターンではHBe抗原陰性パターンに比べ有意に高かった．しかし，HBeAg陽性パターンではウイルス量が極めて少なく，HBeAg陰性パターンではウイルス量が多いものが少数存在した．また.HBsAg陰性または/および抗HBs陽性のHBV感染症も存在する。したがって.臨床の現場ではHBV-MとHBV負荷試験の組み合わせでしか.病態と予後を正しく判断することはできない。中国蘇州市第五人民病院肝疾患科 董福儀（Tong Fuyi)
[キーワード】 B型肝炎ウイルス.ポリメラーゼ連鎖反応.蛍光定量法.酵素免疫法
B型肝炎ウイルス感染者における血清マーカーモデルとウイルス量との関係
董富義，邵威，曹文貴，他 蘇州市第五人民病院感染症科 ，215007
[要旨] 目的 血清マーカーのモデルとB型肝炎ウイルス（HBV）の量との関係を理解する。方法 670名の患者のHBV血清マーカーを酵素免疫測定法で検出し.その中のHBV量を測定した。 結果 5.0e4 /ml以上のHBeAg陽性の患者のHBVコピーは96.3％を占め.HBeAg陰性の患者のHBVコピーより有意に多く.5.0e4 /ml以上の患者は74.8％を占めた。HBeAg陽性患者のHBVコピー数はHBeAg陰性患者より有意に多かった（P < 0.05）．抗HBe抗原陽性者のHBVコピー数は，抗HBe抗原陰性者より有意に少なかった（P < 0.01）．結論 HBeAg陽性患者のHBVコピー数はHBeAg陰性患者より有意に多かったが.HBeAg陽性患者のHBVコピー数は非常に少なく.HBeAg陰性患者のHBVコピー数は非常に少なかった。血清マーカーとウイルス量を調べることで.正確な予後を判断することができます。
血清マーカーとウイルス量を調べることで.正確な予後を判断することができます。近年のPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）技術の飛躍的進歩により.定量的PCR（Q-PCR）が現実のものとなってきています。我々は.蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応（FQ-PCR）法を用いて.HBV感染者670例のHBV-DNAを検出し.HBV-MとHBV量との関係を探った。
1 データと方法
1.1 症例の収集 670例は2002年1月から10月までの当院入院患者である。全例が過去3ヶ月間にインターフェロン.ラミブジン.α1チミジンなどの特別な抗ウイルス剤を使用していなかった。末梢血を採取し.血清を分離して同日中に検査するか.-20℃で保存した。
1.2 HBV-Mの測定：Abbott社（米国）のAXSYMTM自動免疫発光診断装置.補助試薬としてAbbott社が提供する試薬を使用し.専任の担当者が操作した。陽性報告モード。HBsAg (S/N) ≥ 2.00; 抗 HBs (Miu/ml) ≥ 10.00; HBeAg (S/CO) ≥ 1.00; 抗 HBeAg (S/CO) ≤ 1.00; 抗 HBc (S/CO) ≤ 1.00.
1.3 HBV-DNAの定量的判定。リアルタイム蛍光定量PCR法を使用。AcuGen System TMAG 9900 QRM Guantitation RoboMaster全自動定量PCR装置を使用し.試薬はShenzhen Baiyaktai (Biotronics) Companyが提供するAcuGen System supporting reagentsを使用した。検出感度は 5.0e4cps/ml であった。
1.4 統計処理： χ2 検定を用い.比率の比較を行った。
2 結果
2.1 症例データ：男性515名.女性155名.計670名。男女比は3.3：1.年齢は7歳から72歳で.そのうち15歳から60歳が89.6％（600/670人）であった。
2.2 HBV-Mパターン 14のHBV-Mパターンが認められた。HBsAg陽性の8パターンは591例で全体の88.2％を占め（591/670），そのうち1，3，5パターンが50.3％（297/591），1，4，5パターンが30.6％（181/591）であった。6 HBsAg陰性のパターンは合計64例で，その内訳は2,4,5パターンが34.4％（22/64），4,5パターンが23.4％（15/64），2,5パターンが21.9％（14/64）で，合計で全例の9.6％（64/670）であった。HBV-M完全陰性の症例は15例であった。
表 HBV-MとHBV-DNA量との関係
表1 HBVのマーカーとHBVの量との関係
B型肝炎ウイルスマーカー 症例数 HBV-DNA量 HBV量(cps/ml)
HBVマーカー n ＜5.0e4(%) 5.0e4~4.9 e6(%) 5.0e6~4.9 e8(%) ＞5.0 e8(%)
(-) (+) (++) (+++)
1,3,5 297 8(2.7) 69(23.2) 124(41.8)△ 96(32.3)▲
1,4,5 181 46(25.4) 67(37.0) 55(30.4)△ 13(7.2)▲
1,3,4,5 67 4(6.0) 20(29.9) 35(52.2) 8(11.9)
1,5 23 6(26.1) 10(43.5) 4(17.4) 3(13.0)
1,2,3,5 11 1(9.1) 3(27.3) 4(36.4) 3(27.3)
1,2,4,5 9 1(11.1) 4(44.4) 3(33.3) 1(11.1)
1,2,3,4,5 2 1(50.0) 1(50.0)
1 1 1(100.0)
2,4,5 22 18(81.8) 3(13.6) 1(4.5)
2,5 14 12(85.7) 2(14.3)
2 5 4(80.0) 1(20.0)
2,4 1 1(100.0)
4,5 15 12(80.0) 1(6.7) 2(13.3)
5 7 5(71.4) 2(28.6)
否定的 15 14(93.3) 1(6.7)
合計 670 132 186 226 126
* 1：HBsAg.2：抗HBs.3：HBeAg.4：抗HBe.5：抗HBc。△: P < 0.05; ▲: P < 0.01
2.3 HBV負荷：HBsAg陽性パターンのうち。HBeAg陽性パターンのHBV-DNA > 5.0e4cps/ml が96.3%（363/377）.HBeAg陰性パターンのHBV-DNA > 5.0e4cps/ml が74.8%（160/214）であった。HBV-DNA量はHBe抗原陽性パターンでHBe抗原陰性パターンに比べ有意に多かった（χ2=6.07,P<0.05）．パターン1，3，5では，HBV-DNA＜5.0e4cps/mlは2.7％に過ぎなかったが，HBV-DNA＞5.0e4cps/mlは97.3％（289/297），そのうちHBV-DNA＞5.0e6cps/mlは41.8％を占めた。 8％（124/297）.HBV-DNA >5.0e8cps/mlが32.3％（96/297）であった。1,4,5パターンのうち.HBV-DNA <5.0e4cps/ml は 25.4% であり.HBV-DNA >5. 0e4cps/mlが74.6％（135/181）.そのうちHBV-DNA >5.0e6 cps/mlが30.4％.HBV-DNA >5.0e8 cps/mlがわずか7.2％であった。 1 HBV-DNA量は1，3，5パターンでは1，4，5パターンより有意に高かった（P < 0.01）． e8 cps/ml; HBV-DNA <5.0e4 cps/mlは抗HBs陽性パターンの83.3％（35/42）を占めた．2例ではHBV-Mの5マーカーが同時に存在した。(表参照)
3 考察
HBV-Mは.HBV感染後に様々な形で発現する可能性がある。本研究の結果.14の抗原抗体パターンが明らかになった。HBsAg陽性パターンで最も多かったのは.1,3,5パターン（43.0%）であった。HBsAg陰性のパターンでは.1,5パターン（29.1％）.2,4,5パターン（27.8％）が最も多く.次いで4,5パターン（19.0％）.2,5パターン（17.7％）であった。そして.2例がHBV-M陽性であることが判明した。
HBeAgはHBVゲノムのpre-C/C領域のmRNA発現で.HBV-DNAと密接な関係があるため.通常HBeAg陽性者はウイルス複製が活発で感染力が強く.HBeAg陰性者はウイルス複製レベルが低く感染力が弱いとされています。また.本研究の結果.HBeAg陽性者のHBV-DNA量は.HBeAg陰性者のそれよりも有意に高いことが確認された（P < 0.05）。これは.ほとんどの報告と一致しています[1]。しかし，HBeAg陽性パターンでは，HBV-DNA <5.0e4 cps/mlの患者がまだ3.7％あり，これは生体の強い免疫圧によってHBV複製が抑制されるか，血液中のHBV-DNAが肝細胞に組み込まれたためと思われた．HBeAg陰性パターンでは.HBV-DNA > 5.0e4 cps/mlの患者が74.8％.さらにHBV-DNA > 5.0e8 cps/mlの患者が7.2％存在するが.これはHBV遺伝子変異に関係していると考えられ.特にプレC遺伝子またはC遺伝子プロモーターに変異があるとe抗原が発現しにくく.ウイルス複製はまだ存在している[2,3]。
HBsAgの消失と抗HBsの産生は.ほとんどがHBV感染の回復.あるいはB型肝炎ワクチン接種による生体の防御効果を意味する。本研究の結果.HBsAg陰性.抗HBs陽性パターンでは.HBV-DNA > 5.0e4 cps/mlの患者がまだ16.7％存在し.ただウイルスレベルはほとんど高くなく.これはウイルス複製の低レベルと関係があるかもしれない。HBsAg陰性HBV感染は数年前から臨床上のホットスポットである。その理由としては (i)抗原量が少なすぎて検出レベルに達しない.(ii)抗原抗体複合体として存在し.抗体が優勢な場合には抗原がマスクされ.キットの感度が悪く検出できない.(iii)HBV-S遺伝子の変異体.つまり主要親水性領域の一部の変異体がHBsAgを作らない[4].など。HBsAgをコードするS遺伝子の変異に起因すると考えられる。S遺伝子の「a」決定基群は主要な抗原性決定基群であり.この領域の保存アミノ酸置換1つでHBsAgの抗原性を変化させることが可能である。a “型決定基クラスターの変異は.全体の抗体反応に影響を与える。HBsAgは従来の免疫診断試薬で検出されるが.体内で産生される抗HBsは変異したHBVを中和できない。また.HBVには地理的分布と「a」determinant clusterの配列に多型を持つ異なる亜型が存在する[5]。我々の研究では.HBsAg陰性または/および抗HBs陽性患者が少数の血清でHBV感染を有しており.HBsAgおよびHBeAg力価はHBV-DNAレベルと相関していた[6]。 レベルは相関していた[6]。また.抗HBs抗体検査の結果は.試薬の出所だけでなく.受けたB型肝炎ワクチンの出所の違いも関係している可能性があります[7]。
ウイルスの複製過程にはパッケージングタンパクの発現も伴い.これらの異種タンパク質（抗原）は身体の免疫系を刺激して.対応する抗体を産生させます。このように.抗原性抗体は.ウイルスの発現レベルを反映し.間接的にウイルスの複製レベルを反映する。血清学的手法は.B型肝炎の病因の分析（病因診断）.感染性.疾患の進行および予後にも利用することができます。しかし.HBVの発現や体の免疫反応の強さはいくつかの要因に影響され.免疫学的指標は臨床現象やウイルス量と正確に一致しない可能性があります[8]。HBV逆転写酵素阻害剤の普及やウイルス変異体の広範な存在により.多くの臨床現象はもはや免疫学的指標だけでは完全に説明できない。血清学的検査は.HBV-DNA検査の完全な代替にはならない。ウイルス量は血清検査よりも定量的な指標であり.臨床現象やその変化の傾向を反映する上で.血清検査よりも正確かつ高感度である可能性がある。しかし.この2つは互いに完全に置き換えることはできない。したがって.HBV-Mの臨床検査にはHBV-DNA量の検査を伴う必要があり.一方に偏った強調だけでは.両者の組み合わせによって疾患や予後を正しく判断することはできない。
参考文献
1 Kessler HH, Preininger S, Stelzl E, et al.
定量的PCRアッセイによるB型肝炎ウイルス感染の異なる状態の識別。Clin Diagn Lab Immunol 2000;7:298~300
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3 藤原和彦.横須賀修.江幡崇.他：無症候性キャリアにおけるB型肝炎ウイルスDNAの2つの状態
無症候性キャリアにおけるB型肝炎ウイルスDNAの2つの異なる状態。HBe抗原陽性と抗HBe抗体陽性の無症候性キャリア。ディグ・ディス・サイエンス 1998;43:368~376
4 Luo, Anti-Sen, ed. Hepatitis B basic and clinical. 2nd ed. Beijing: 人民衛生出版社.2001.334~335
5 同復也.白潔也.唐亦赫.他 江蘇省南部におけるB型肝炎ウイルスS遺伝子配列の多型性研究。中国と西洋
中国と西洋の医学と肝臓病の融合雑誌, 2002;12(5):260~262
6 Shao W, Tong FY, Ruan CJ. HBsAg.HBeAg 力量と HBV-DNA 値の関係。胃腸病学と肝臓病学
Zhi, 2003;12(5):475~476
7 Heijtink RA, Schneeberger PM, Postma B, et al. B型肝炎予防接種後の抗HBsレベルは検査試薬に依存する：ルーチンに決定される10および100IU/L血清保護レベルの信頼性はない. Vaccine,2002,20:2899~2905
8 Weston SR, Martin P. Serological and molecular testing in viral hepatitis: an update.Can J Gastroenterol,2001.
Gastroenterol,2001,15:177~184