目的 ヒト前立腺癌 PC-3 細胞のアポトーシスに対するメリチンの作用とその可能な機序を検討する。 方法 ブランク対照群およびメリチンの濃度を変えた群を用いて.MTTによる細胞増殖.Hoechst 33258染色によるアポトーシス.RT-PCRによるp27およびp53 mRNA発現.ウェスタンブロットによるタンパク質発現の検出を行った。 結果 対照群と比較して.24.48.72時間後.4.8.16.32ug/ml群ではMTTのOD値が有意に低く.アポトーシス率が有意に高くなり（P<0.05）.48時間後にはp27とp53 mRNAの発現が有意に高くなった（P<0.05）。 結論 ハチ毒ペプチドは PC-3 細胞に対してアポトーシス誘導作用を有し.その作用機序は p27.p53 および caspase3 の発現増加に関連している可能性が示唆された。 広東省中医薬病院泌尿器科 Lv Liguo
前立腺がんは.世界で2番目に多い男性悪性腫瘍であり[1].米国では男性悪性腫瘍の中で発症率が1位となっています。 診断時に進行していることがほとんどです。 進行性前立腺がんの治療は内分泌療法が中心ですが.中央値で14〜30カ月経過すると.ほとんどの場合.生存期間の中央値が短い除細動抵抗性前立腺がん（CRPC）に進行してしまいます。 進行性前立腺がんのCRPCへの進行をいかに遅らせ.CRPCの生存期間をいかに延長させるかは.世界的な治療課題となっています。 CRPCの治療において.漢方薬の研究は徐々に注目されるようになってきました。 予備的な臨床研究により.ハチ毒を主成分とするハチ鍼療法は前立腺癌の進行を抑制する一定の効果があること.ハチ毒ペプチドはハチ毒の主成分であることが示されている。 本研究は.ハチ毒ペプチドのPC-3細胞のアポトーシスに対する効果およびその作用機序について現代医学研究の結果と合わせて検討し.さらなる臨床応用に向け理論基盤を提供するとともにCRPC治療へのアイデアを提供することを意図している。
1.材料と方法
1.1 試験薬物 ビーベノムペプチド.米国Sigma社より購入.純度91.8%.バッチ番号060M4079V.培養液で最終濃度1.2.4.8.16.32ug/mlに希釈したもの。
1.2 細胞 前立腺癌 PC-3 細胞は.Sun Yat-sen University Experimental Animal Centre の Cell Laboratory から購入したものである。
1.3 試薬 Tetrazolium methyl azole blue (MTT), Sigma, USA; DMEM medium, fetal bovine serum, 0.25% trypsin digest, Hyclone, USA; Annexin V/PI apoptosis assay kit, RNA extraction reagent Trizol, Invitrogen, USA; Reverse transcription kit, fluorescent quantitative PCR kit, Takara, Inc. 米国タカラ社。使用した化学試薬はすべて分析的に純粋なもので.広州化学試薬廠から購入した。
1.4 装置 酵素マーカー（Perkin Elmer, USA）.フローサイトメーター（Beckman Coulter, FC500, USA）.7500 リアルタイム定量蛍光遺伝子増幅システム（ABI, USA）.ゲルイメージングシステム（Bio-Rad, USA）．
1.5 方法 前立腺癌 PC-3 細胞を 5%FBS含有 DMEM.37℃.5%CO2.飽和湿度恒温槽で培養し.0.25%トリプシン消化で継代培養を行った。 実験は.1, 2, 4, 8, 16, 32ug/mlのグループとブランクコントロールのグループで24,,48, 72h行った。 各実験は3回繰り返した。
1.5.1 MTTアッセイ 消化後の細胞を数え.96ウェル培養プレートに1ウェル100μLずつ接種し.5反復のウェルを設定し.細胞が壁に付着した後.薬剤を添加し.24,48,72h培養後.5%MTT溶液20μLを加え.4h培養を続けたのち上清を吸引.DMSO溶液100μLを各ウェルに加え.室温で振り.10分溶解後酵素標準によりOD値検出をした。 570nmのOD値。 細胞増殖抑制率＝（対照群のOD値-薬剤群のOD値）／対照群のOD値×100％。
1.5.2 Hoechst 33258 染色によるアポトーシスの検出 6 ウェルプレートに細胞を接種し.上記の処理群に準じて培養を行った。 効果終了後.説明書に従ってHoechst 33258染色液を加えて染色し.倒立蛍光顕微鏡でアポトーシス率を検出した。
1.5.3 RT-qPCR による mRNA 発現 細胞をグループ分けして処理した後.細胞を回収して Trizol で total RNA を抽出し.濃度を測定して逆転写により cDNA を合成した。 p53 mRNA の発現は SYBR Green dye 法による蛍光定量 PCR (Real Time PCR) により解析し.内部標準遺伝子 GAPDH で補正を行った。 プライマー配列は以下の通り：p53遺伝子フォワードプライマー：5′-ATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATG-3′.リバースプライマー：5′-TCAACAAGATGTTTTGCCAACT-3’である。 GAPDHフォワードプライマー：5′-TCTTTTGCGTCGCCAGCC GA-3′.リバースプライマー：5′-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTGACCA-3′.p27kipフォワード プライマー：5′- AGTGTCTAACGGGAGCCCTA -3′.リバースプライマー：5′- CCGGGTTAACTCTTCGTGT-3.
1.6 統計解析方法 データは平均値±標準偏差で表し.SPSS 19.0 統計ソフトウェアを用いて.検定レベルα=0.05で一元配置分散分析を実施した。
2.成果
2.1 MTT試験結果 コントロール群と比較して.4.8.16.32ug/mlの濃度でハチ毒ペプチドを作用させるとOD570nmが有意に減少したことから.ハチ毒ペプチドはPC-3細胞の増殖を抑制できる.あるいはアポトーシスを促進できることが示唆されたが.そのうち8.16.32ug/ml濃度のグループ間で効果に有意差がなかったため.以降の実験濃度として1.4.8ug/mlが選択された。
2.2 Hoechst染色結果 ハチ毒ペプチドはアポトーシスを誘導できる。 48時間作用後.対照群と比較して.1ug/mL群では明らかなアポトーシスは認められず.4ug/mL群ではアポトーシス率が著しく上昇し.8ug/ml濃度では70%以上のアポトーシス率が確認された。
2.3 RT-PCRの結果.PC-3細胞におけるp53およびp27タンパク質の相対発現量は.ハチ毒ペプチド効果後に有意に増加することが示された。
2.4 ウェスタンブロットアッセイ 蜂毒ペプチド作用48時間後.1ug/mL群.4ug/mL群.8ug/mL群でp53の発現量が増加.4ug/mL群.8ug/mL群でProcaspase3の活性化.Caspase3含量の増加.アポトーシスが増加した。
3.ディスカッション
蜂鍼は.抗腫瘍効果を持つ伝統的な中国医学療法であり.予備的な臨床研究により.蜂鍼が前立腺がんの進行を抑制する潜在的な役割があることが示されています。 ハチ毒ペプチドはハチ毒の主成分で.様々な抗腫瘍効果があり[2].実験的研究により.ハチ毒ペプチドが前立腺がん細胞に対して増殖抑制作用やアポトーシス誘導作用を持つことが確認され.考えられる作用メカニズムの一部が明らかにされています[3.4]。 Bcl-2/bax imbalance [5].P53タンパク質の過剰発現 [6].Survivinの過剰発現 [7,8].Caspase経路 [9,10] など.前立腺癌細胞の増殖とアポトーシスを制御する多くのメカニズムが同定されています。 そこで.ハチ毒ペプチドの前立腺がん細胞に対する効果やメカニズムをさらに明らかにするため.上記の実験を行った。
実験の結果.対照群と比較して.ハチ毒ペプチドは24.48.72時間後にPC-3細胞の増殖を有意に抑制することが確認された。また.4.8.16.32ug/mlの濃度では48時間後にPC-3細胞のアポトーシス細胞と死細胞数が有意に増加し.ハチ毒ペプチドが前立腺癌PC-3細胞のアポトーシス誘導作用を有することが示された。 さらに.ハチ毒ペプチド処理後のPC-3細胞では.p27とp53 mRNAの発現が有意に増加していることがわかり.p27とp53の制御がアポトーシス誘導経路の一つであると推察された。
p27は細胞周期の負の調節因子であり.癌遺伝子と考えられている。 正常細胞および腫瘍細胞において.p27は細胞周期の進行を負に制御し.細胞周期依存性プロテインキナーゼの活性を阻害することで細胞増殖を抑制している。 また.p27は細胞分化の制御やアポトーシスの誘導に関与していることが分かっている[11]。 したがって.ハチ毒ペプチドは.p27の発現を調節することによりPC-3細胞のアポトーシスを誘導することができると考えられる。
p53は.様々なメカニズムで腫瘍の発生を防ぐことができるがん遺伝子です。 また.転写因子や成長抑制タンパク質として.前立腺がんの発生に重要な役割を果たします。 研究[12]により.PC-3細胞においてp53タンパク質がアポトーシスを誘導すること.またp53依存性のアポトーシス経路が存在することが確認されました。 本研究では.蜂毒ペプチド処理後にp53の発現が有意に上昇したことから.蜂毒ペプチドがp53の発現を調節してPC-3細胞のアポトーシスを誘導する経路の一つであると推測された。p53はProcaspase3の切断を活性化して.Caspase3の活性化につなげることができる。
カスパーゼは.アポトーシスに重要な役割を果たす相同タンパク質で.アポトーシスの中心的存在であり.アポトーシスに重要な役割を果たす。 中でもカスパーゼ3は.アポトーシス時に活性化される重要なキナーゼであり.アポトーシスの実行者.アポトーシス時の優勢な終末せん断酵素.CTLにおける細胞死メカニズムの重要な構成要素です。カスパーゼ3タンパク質は進行性前立腺癌細胞におけるアポトーシス耐性特性.悪性度.再発と関連していると言われています。 低カスパーゼ3陽性は.進行性前立腺がんの発生.進行および予後と強く関連している[13]。カスパーゼ3活性の低下は.ホルモン非依存性前立腺癌の発生および進行の過程と関連している[14]。 ある種のハーブエキス[15,16]がカスパーゼ3の発現をアップレギュレートすることにより.PC-3細胞の増殖を抑制することが研究で明らかにされています。 今回の実験では.ハチ毒ペプチドの作用後にカスパーゼ-3含量が増加したことから.ハチ毒ペプチドがPC-3細胞にアポトーシス誘導作用を及ぼす経路の1つとしてもカスパーゼ-3チャネルが想定されました。
この実験により.ハチ毒ペプチドのPC-3細胞に対するアポトーシス誘導作用とその可能なメカニズムが明らかになり.ハチ鍼療法のさらなる臨床応用のための理論的根拠とCRPCの治療に対するアイディアがもたらされたのです。 PC-3細胞に対するハチ毒ペプチドのアポトーシス誘導作用に他の経路があるかどうか.また.これを基にハチ毒ペプチドを組み合わせた前立腺がんの生物学的治療を行う方法について.さらに深く研究する必要がある。
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