肺の真菌感染症患者は.様々な臨床症状や非典型的な画像所見を有するため.臨床病理検査が診断の重要な基礎となる。 “今回の成果は.侵襲性真菌症の診断・治療において重要な参考となることは間違いありません。 体液検体の違いによる顕微鏡検査や培養結果の価値については.臨床の現場ではまだ議論の余地があり.この問題について.臨床診断や治療の参考となるように考察を加えたものである。
1.検体の採取と処理
1.1 適格な喀痰検体の入手と処理
喀痰は呼吸器感染症の病原診断に最も重要かつ一般的に用いられる臨床検体であり.喀痰の正しい採取方法と喀痰検体が適格であるかどうかは.真菌培養における病原細菌の検出にも極めて重要である。 真菌喀痰検体は，細菌培養と同様に，肺真菌症が臨床的に疑われ，抗真菌薬を使用する前に採取し，必要に応じて複数回採取し，2時間以内に検査に回すか，間に合わなければ4℃で保存し，24時間以内に処理する必要があります。 現在.臨床検査に回される喀痰検体の合格率は40〜60％に過ぎない。 正しい採取方法は.患者さんに口をゆすいでもらい.深く咳をしてもらい.膿性の痰や分泌物を保持して検査する方法です。 ニューモシスチスの検査が必要な痰のない患者には.高張食塩水のネブライザー吸入で痰を誘発することができる。
喀痰検体は.下気道検体の病原性検査として.塗抹検査→培養の原則に従って取り扱われるべきであるが.臨床現場では通常.喀痰培養のみが重視され.喀痰塗抹顕微鏡検査は軽視されることが多い。 喀痰塗抹の結果は.診療所にとって非常に重要な間接的・直接的診断価値を持つことを強調することが重要である。 まず.喀痰塗抹顕微鏡検査では.有能な喀痰検体のスクリーニングが可能です。 これは.扁平上皮細胞＜10／低倍率.多核白血球＜25／低倍率.あるいはその両方の比率が＜1：2.5であれば.検体の膿性部分の塗抹を採取してグラム染色することで可能である。 次に.喀痰塗抹標本をヘマトキシリン・エオジン（HE）染色や関連する特殊染色で染色し.病原体を直接顕微鏡で観察することができる。 HE染色は非特異的真菌染色法で.菌糸の識別をある程度まで向上させることが可能である。 ヘキソサミン銀（GMS）や過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）などの真菌特異的染色剤を用いると.Aspergillus.Trichoderma.Candidaなどの真菌病原体を染色することができ.両者を組み合わせることで真菌病原体の検出率をさらに向上させることができる[1]。 アスペルギルスやトリコデルマ菌糸体.カンジダ偽菌糸体.発育胞子などの呼吸器検体は.より臨床的に重要である。
1.2 気道内吸引の取得と検体処理
気管挿管や気管切開を行った患者において.人工気道から吸引された気道分泌物の顕微鏡検査や培養は.呼吸器感染症の病原診断の重要な基礎となり.喀痰検体よりも信頼性が高いとされている。 文献によると.病原性試験の感度および特異性は高いことが示されています[2]。 気管内吸引は.ほとんどがブラインド吸引で行われます。 手術前に患者の全身状態をできるだけ改善し.十分な酸素を投与する。 人工呼吸器支持患者の場合.手術中の低酸素血症を防ぐために純酸素吸入を短時間行うことができる。 すべての操作は無菌の原則に従い.滅菌した吸引チューブや痰取り器を使用し.吸引前に陰圧を150～200mmHg（成人）に調整し.間欠吸引で穏やかに機敏に操作する必要があります。 検体の取り扱いは.基本的に喀痰検体と同じです。
呼吸器分泌液の半定量培養の「12段階法」と直接塗抹標本検査の「7段階法」の精度に関する大規模な臨床報告はありませんが.グレーディングレポートの結果は.より臨床的な参考値を提供することができます。 血液プレート1枚.チョコレートプレート1枚.サボプレート1枚に呼吸器分泌物検体の膿性部分と直接塗抹を1枚ずつ植え付けた。 チョコレートプレートはキャンドルジャーに.その他のプレートは通常のインキュベーターに入れ.35℃で48時間培養する。コロニーの形態を観察し.様々なコロニーをピックアップし.最初のゾーンに混ぜる。
グラム染色.油彩顕微鏡。 細菌（真菌を含む）の培養結果を「12段階法」に従って.3枚のプレートすべてで細菌（真菌を含む）が増殖しないのは（-）.サボまたはチョコレートまたは血液寒天でのみ増殖する.または計数ゾーンでは全くないが非計数ゾーンでは見える.または様々なコロニーのうち100を計数した結果を記録し報告すること。 特定の細菌（真菌を含む）のコロニー数が1～4個であれば.検体が小さい（＜0.1）と判断し.5～14個で0.1.15～24個で0.2.25～34個で0.3.など.純粋培養は1。 ダイレクトスメアグラム染色油面顕微鏡では.まず以下の「7段階法」により標本の質を判断する。 塗抹標本検査の結果は，塗抹標本全体に真菌の菌糸や胞子が見られない場合を（-），100視野あたり3視野を非常に少ない，100視野あたり3～9視野を少ない，10視野あたり1～9視野を（＋），10～99視野を（ ）として，「7段階法」で記録・報告した． +++）; (++++)として.1視野あたり≧100とした[3]。
1.3 保護用ブラシのサンプリングとサンプルの取り扱いについて
喀痰培養検査と比較して.経気管支鏡ガイド下保護ブラシ法（PSB）または盲検法（BPSB）は.検体汚染が少なく.精度・再現性に優れています[4,5]。 経口・経鼻挿入の場合は.気管支鏡検査をルーチンに行い.可能であれば気管支鏡挿入時に分泌物の吸引を行わない。 人工気道から気管支鏡を挿入する前に.十分な酸素を投与し.人工呼吸器でサポートされている患者は.サンプリングプロセス中に人工呼吸器の使用を維持するためにティーチューブを使用することも可能である。 画像上位置する病変部（好ましくは最も明らかな浸潤性病変または膿性分泌物がある部位）に気管支鏡を誘導した後.トロッカーおよびブラシを順に導入し.病変部から分泌物をブラッシングし.ブラシをトロッカーに収納した後トロッカーを抜去する。 カニューレの外壁と先端を75％医療用エタノールで消毒した後.ブラシを伸ばして1mlの滅菌生理食塩水の入ったチューブに浸し.よく振ってから滅菌密封チューブで培養に回す。
BPSBは人工気道が確立されている患者さんにも使用でき.現在は主に人工呼吸器関連肺炎の病原診断に用いられており.気管支鏡ガイド下PSBとBPSBの診断効果に大きな差がないとする文献もあります[4]。 操作は.気管チューブやカニューレを介して.適切な深さ（経鼻・経口気管挿管では約30～50cm.気管切開では20～40cm）でゆっくりと挿入します。 貫通に抵抗がある場合は.ブラシを伸ばして分泌物を除去し.ブラシ後退後に抜去します。 その後の操作や試料の取り扱いは従来通りです。
1.4 気管支肺胞洗浄液の採取と処理
気管支肺胞洗浄液（BALF）の顕微鏡検査と培養は.感染性肺疾患の診断に最も信頼できる方法です。 文献では.侵襲性肺真菌症と確認され臨床診断された患者のBALFの直接顕微鏡検査陽性率は30.9%.培養は27.4%と報告されています[6]。 中国における気管支肺胞洗浄液の細胞診検査に関する技術仕様書（案）では.①洗浄部位：びまん性間質性肺疾患では右肺の中葉（B1 または B5）または左肺の舌側部を選択.限定肺疾患では対応する気管支肺節を洗浄することが規定されています。 手順：洗浄する肺セグメントに.生検孔からシリコンチューブを通して2％リドカインの局所麻酔を1～2ml注入し.フィブリノスコープの先端をセグメントまたはサブセグメントの気管支口に密着させ.37℃の滅菌生理食塩水を1回25～50ml.合計100～250ml素早く注入し.直ちに50～100mmHgで陰圧吸引して洗浄液を回収し.通常40％の回収率で～洗浄液を回収します。 回収率は通常40〜60％です。 回収した液は直ちに二重の滅菌ガーゼでろ過して粘液を除去し.総量を記録した後.滅菌容器に詰めて低温で氷上送付し.検査に使用する。 適格基準：BALFに気道分泌物が混入していない.回収率40％以上.生存細胞95％以上.赤血球10％未満（外傷・出血要因を除く）.上皮細胞3～5％.塗抹細胞の形態が完全.歪みがない.分布が均一である。
人工気道を確保する際.特に人工呼吸器で治療している重症患者には.より侵襲性の低い盲検ミニ気管支洗浄法（BMBL）が推奨される。 手術は.事前に純酸素を1分間吸入させ.滅菌吸引チューブを取り.手動の気道に通し.ゆっくりと気管支扁桃に送り込んでから.滅菌生理食塩水を20～30ml注入し.3ml以上の回収量を確保して行われる[7]。 検体を遠心分離し.沈殿物の塗抹を採取し.観察または培養を行う。
1.5 尿検体の保存と処理
尿の顕微鏡検査や培養は侵襲性真菌症ではあまり意味がないが.Candida spp.やPenicillium manefaciensが検出されれば.ある程度の診断価値がある [8]． 検体採取は抗生物質の投与に先行して行うことを目標とし.できれば午前中に清潔な中尿を保持し.不活性物質でできた広口の滅菌容器に採取し.蓋を閉めて保存することが望ましい。 留置カテーテルでの採尿は.まずカテーテルの外側を消毒し.無菌操作に従ってシリンジでカテーテルを穿刺して尿を吸引する。採尿バッグからの採取は禁忌である[9]。 尿検体は室温で2時間以内.4℃で8時間以内の保存が必要です。 尿沈渣の顕微鏡検査は.検体5～10mlを3000～4000r/minで30分間遠心分離し.沈渣スメアを採取して直接顕微鏡検査または関連染色後の顕微鏡検査に供する。 尿培養は植菌ループで対応する培地に塗布し.遠心分離後の尿沈渣培養を取ることで陽性率を上げることができます。 18～24時間培養して菌の増殖がない場合は.24時間培養を続けてから観察する必要があります。
1.6 血液
血液培養による病原細菌の検出は.侵襲性真菌症の診断において重要な基盤の一つである。 操作はルーチンの細菌培養血液検体採取と同じで.無菌の原則に注意し.抗真菌薬塗布前のより良い採血.培養のために二重血液の異なる部分を取るべきである；血管内留置カテーテルがある場合.少なくともカテーテルを通して採取した血液検体を含めるべきである；同時にカテーテルを抜いた場合.同時にカテーテルの先端を培養に送るべきである。
1.7 胸水
胸水は侵襲性真菌症患者の36％にみられるが[6].胸水培養が陽性となることはまれで.無菌腔液として確認価値がある。 胸水検体は遠心分離し.沈殿物を採取して直接塗抹標本顕微鏡検査.または培養のために接種する必要がある。
2.陽性臨床検体の解釈
2.1 カンジダ
カンジダ臨床検体は分離率が高く.健常者の20〜55％の喀痰からカンジダが分離され.気道にコロニーを形成することが多いため.喀痰カンジダ培養陽性はコロニー形成か感染かの区別がつきにくく.その臨床意義には限界があり.その陽性結果は慎重に解釈しなければならない。気管支鏡下に保護ブラシで調べた検体の培養結果が陽性でも.侵襲性カンジダ感染の診断基準として使うことはできない。 臨床試験では.喀痰およびBALF培養でカンジダが陽性であった患者でも.抗真菌治療を行わない限り.全身感染症を発症せず.死亡率も上昇しないことが示されている[10,11]。 喀痰培養が複数回陽性であれば.カンジダの汚染やコロニー形成の可能性を排除できることが示唆されているが.現在の国内外のガイドラインでは.気道検体のカンジダ陽性培養を微生物学的診断根拠としておらず.これを根拠にした抗真菌療法も推奨されていない[12]。
気道検体の直接顕微鏡検査は.培養よりも大きな価値を持つ。 カンジダは酵母に似た真菌で.コロニー化した状態では少数で.ほとんどが胞子状でゆっくりと成長する。 顕微鏡検査でカンジダが仮性菌糸（出芽胞子）を形成し.一定の条件下で真性菌糸に変化することが判明した場合.感染する可能性があります。 したがって.実力喀痰検体.誘発喀痰.BALFを直接顕微鏡で観察すると.多数の出芽菌やカンジダ菌糸が認められ.急速に増殖していることがわかり.病原性がある状態である可能性があります。
カンジダのコロニー形成は侵襲性感染症の発症の必須条件であり.重症患者におけるカンジダのマルチサイトコロニー形成は侵襲性カンジダ感染症発症の独立したリスクファクターである[13]。 colonization index (CI) やcorrected colonization index (CCI) は.臨床検体の定量培養技術を用いて患者のコロニー形成負荷を把握し.ハイリスク群の早期発見と先制治療の指針とするものである。 患者の気道吸引液（喀痰）.咽頭スワブ.胃液.尿.直腸スワブ（糞便）から5検体を採取し.半定量的にカンジダ菌を定量する。 咽頭・直腸スワブで1 x 102 コロニー形成単位（CFU）/ml以上.胃液.気道吸引液.尿で1 x 105 CFU/ml以上のカンジダ数を陽性と定義。 CCI＝陽性部位総数/検体総数。 抗カンジダ療法は.現在.CCI≧0.4の高リスク集団の敗血症患者に早期に行うべきと考えられている[13]。 その結果.カンジダ感染症の発症より平均6日早くコロニー形成指数の閾値に到達することが判明し.これは高い臨床的予測価値を持ち.これに基づくカンジダの臨床的先制治療は.薬剤耐性率を高めることなく侵襲性カンジダ感染症の発症を大幅に減少させることができることがわかりました[14]。
したがって.臨床的な抗カンジダ治療は喀痰培養の結果のみに基づいて行うのではなく.その時々の患者の臨床的危険因子（特に粘膜バリアの破壊.既存カンジダのコロニー化.免疫抑制など）.対応する臨床症状や画像変化.喀痰や気道分泌物の塗抹所見（偽菌糸や菌糸.出現胞子の有無など）.コロニー化指数（特に補正コロニー化指数）に言及することが必要とされます。 臨床的価値は.血清マーカー（G-testなど）の結果や経験的治療の必要性と併せて判断されます。 細菌感染など他の原因では説明できない呼吸器感染症や胸部画像上の新しい病変を示すカンジダの血液培養陽性患者において.複数の喀痰培養陽性と血液培養の一貫した結果は.カンジダ二次感染の微生物学的根拠として用いることができる。
無菌性腔液（血液および胸水）中のカンジダ陽性培養は.侵襲性カンジダ感染症の診断を確定するための重要な微生物学的根拠となるものである。
尿沈渣塗抹顕微鏡検査は.尿路カンジダ感染が疑われる場合に適応されます。 カテーテルがない患者では.2つ以上のカンジダ陽性培養を微生物学的診断の根拠とすることができるが.カテーテルがある患者では.陽性培養を微生物学的診断の根拠とすることができない。 尿検体培養陽性の解釈は.臨床的な文脈で解釈されなければならない。 臨床症状がない場合.患者がカンジダ感染の高リスクにない限り.一般的にカンジダ尿の治療は勧められない。素因を除去すれば.通常カンジダ尿は治まる。 ただし.症候性カンジダ症や.カンジダ症患者で播種性カンジダ症が疑われる場合は.治療を行う必要があり.レジメンはカンジダ症に準ずる。
近年では.カンジダ・アルビカンス以外の感染症の割合が増加しています[15]。 前世紀末にフランスのCHROMagar社によって開発されたCandida発色培地は.Candida albicans（青緑）.Candida tropicalis（青）.Candida klebsiella（ピンク）.Candida smoothis（ピンク）.Candida subsmoothis（薄白）などの一般的なCandida属の病原体を1回の培養で直接確認できるようにした。 本法により.早期の臨床種判定が可能となり.早期治療のための薬剤選択の参考となる。
2.2 アスペルギルス
アスペルギルス属の芽胞は直径2～5μmで空気中に浮遊しやすく.芽胞を吸引してアスペルギルス症を引き起こすことがあり.主に肺炎や副鼻腔炎で.気道検体から検出されることが多く.汚染やコロニーの可能性があるため結果の解釈には注意が必要である。
臨床検体の塗抹標本顕微鏡観察では.10％水酸化カリウムで前処理をすることで.菌糸の完全性を確保しながらタンパク質成分を除去し.観察しやすくすることができます。 顕微鏡検査の感度をさらに高めるために.さまざまな染色法があり.染色後に顕微鏡で観察すると.細く鋭く分岐・分離した菌糸の存在がアスペルギルス菌糸であることを確認することができる。 菌糸の量が少ない場合.菌糸の断片しかない場合.壊死した組織が多い場合などは.検出率が著しく低下します。 GMS染色は.染色剤が真菌細胞壁の多糖類に結合した後.アルデヒド基を介してヘキソサミン銀を黒色の金属銀に還元し.菌糸が黒く見える特異な染色剤である。 アスペルギルス染色は.GMS染色やPAS染色と組み合わせることで.アスペルギルスフィラメントの検出を向上させることができる[1]。
アスペルギルス属菌は標準培養での増殖に適しており.ほとんどの研究室では菌種を同定することが可能です。 グループはコロニーの形態と分生子頭部の色で分類され.次に分生子の形態と色.胞子生産構造の数.先端カプセルの形態.性胞子の形態によって種が同定される。
アスペルギルス症の臨床気道検体の分離は十分ではなく.アスペルギルス培養の感度および特異性は限られており [12].BALFにおけるアスペルギルス培養の陽性率は15％未満である [16]。 2008 American College of Infectious Diseases clinical practice guidelines for diagnosis and management of Aspergillosisでは.有能痰検体.気管内吸引.BALFまたはブラシ検査検体などの気道検体の顕微鏡的検出.連続2回分離痰検体の培養から.次のことを提案している：アスペルギルス症の臨床的な診断および管理。 アスペルギルス種とBALFの単一陽性培養は.肺アスペルギルス症の診断のための微生物学的根拠として使用することができる[17]。 しかし.臨床医は.この結果と宿主因子や臨床的特徴とを組み合わせて.その臨床的意義を判断する必要性を依然として認識しているはずである。
アスペルギルス症患者において血液培養が陽性となることは稀であり.全身感染が生じた場合でもアスペルギルス血液培養の陽性率は低いため.アスペルギルスに対する血液培養陽性は外来性の汚染を排除するために慎重に解釈されなければならない。 胸水培養が陽性であれば.診断を確定することができるが.臨床ではまれである。 検体採取前に全身性抗真菌療法を受けている場合.微生物検査が陰性でも侵襲性アスペルギルス感染症の可能性を排除できないことに留意することが重要である。
2.3 クリプトコッカス
クリプトコッカス感染症は.Cryptococcus neoformansの検出が最も一般的で.検出に用いられる染色には.HE染色.インク染色.PAS染色.Alcian blue染色.GMS染色などがある。 HE染色.GMS染色はCryptococcusを容易に検出できるが.CandidaやHistoplasmaと混同されることがある。 インク染色は.通常.脳脊髄液や分泌物の塗抹標本に含まれるクリプトコッカスの確認に用いられ.陽性率は約60％である。 簡便.迅速.低コストという利点があり.塗抹標本のクリプトコックス感染の確認に適した方法であるが.粘性の高い呼吸器分泌物への適用には適していない。 クリプトコッカス・ネオフォルマンスの識別には.一般的にアルシンブルー染色法が用いられます。 クリプトコッカス・ネオフォルマンスの封入膜は粘液物質で.他の菌やさやが着色しないのに対し.アルシンブルーとカーマインで着色できることから.アルシンブルー染色法はクリプトコッカス・ネオフォルマンスに比較的特異的で.形態や大きさが似ている酵母と区別することが可能です。 診断は.円形または楕円形の本体と広い外被膜の存在によって行われる。
クリプトコックス脳脊髄液の培養は.3～5ml以上の検体から採取して検査することが望ましい[18]。 典型的なクリプトコッカスのコロニーは2〜5日で形成され.顕微鏡検査にかけると仮骨形成のない円形または楕円形の体として見ることができる。
クリプトコックス症患者の臨床気道検体では，喀痰培養・塗抹は一般に25％以下の陽性率である． Cryptococcus neoformansは健常者にも存在するため.喀痰や気管吸引培養でもCryptococcus neoformansが存在する場合は.臨床ベースで肺クリプトコックス感染症の有無を判断する必要があります。 通常.健康な気道にはクリプトコックスは存在しないが.慢性構造肺疾患患者はコロニーを形成している可能性が高い[19]。 肺炎球菌感染症では.免疫力のない患者さんでは全身.特に中枢神経系に播種する傾向があり.そのような患者さんが外科的病理診断で確定診断された場合や外科的治療を受けた場合には.肺外播種の可能性が高くなると懸念されています。 したがって.髄膜炎が疑われる患者にはできるだけ早期に脳脊髄液検査を行う必要があり.初期の髄膜炎では塗抹陽性率が85％以上.培養陽性率も高いのが特徴です。 肺クリプトコックス症が確認された患者におけるルーチンの脳脊髄液検査の必要性に関する決定的な証拠はないが.免疫機能に異常がある患者には推奨される[20]。
2.4 ニューモシスチス
ニューモシスチス肺炎（PCP）は.日和見病原体であるPneumocystis epidermidisによって引き起こされる肺感染症である。 ニューモシスチスにはカプセル型とトロフォゾイト型の2つの病原体があり.AIDS患者の主要な死亡要因の一つとなっている。 PCPは高い罹患率と死亡率を有していますが.早期診断と迅速な治療により70%の患者さんが治癒可能です。
ニューモシスチスは.他の真菌と異なり.信頼性の高い培養法では検出できないため.その感染を確認するには.特異性の高い様々な染色技術による病原体の直接観察が主な方法となる。 ニューモシスチスの莢膜や栄養体の検出によく用いられる染色法には.GMS染色.Richter-Giemsa染色.Pap染色.蛍光増白染色（CW染色）などがある。 GMS染色はニューモシスチスの嚢壁を選択的に染色し.診断感度は76.9％.特異度は99.2％である[21]。リヒター・ギエムザ染色は病原体のすべてのステージを染色し.塗抹顕微鏡検査に適している。 パップステインは.「泡状体」と呼ばれる病原体周辺の好酸性物質を染色するもので.感度.精度ともに信頼できる診断方法である[19]。 PCPは.BALFまたは誘発喀痰中の病原体を直接顕微鏡で検出することにより.最も確実に診断される[22]。
3 まとめ
侵襲性真菌症の診断・管理においては.一方で臨床検体.特に気道検体の顕微鏡検査や培養が軽視され.喀痰培養陽性結果の意義を無視したり.一方的に汚染やコロニー形成を認定して治療の最適タイミングを遅らせるなど.不適切な解釈をするケースが見受けられます。 一方で.結果の臨床的価値を過大評価し.気道検体の培養陽性が侵襲性真菌症の臨床診断の「微生物学的証拠」となり.過剰な治療につながる傾向もある。
新しい微生物抗原検査や分子生物学に臨床的に依存し.臨床検体の顕微鏡検査や培養を犠牲にすることは避けるべきである。 多くの場合.顕微鏡検査は.より迅速で費用対効果が高く.信頼性の高い検出方法であると考えられます。 同時に.検体の顕微鏡検査と培養は.その結果が臨床医の診断における強力な証拠となるように.有能な検体採取方法と標準化された検体処理手順に基づいて行われるべきである。 臨床的解釈においては.局所の微生物学的特徴.危険因子.臨床症状.他の検査結果との関連で総合的に判断する必要がある。
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