慢性非治癒性創傷は.まだ明確な定義はないが.通常.様々な内因性または外因性の要因により.通常の創傷治癒過程を経て治癒せず.病的な炎症反応の状態に入り.結果として創傷治癒が持続する創傷と理解されている[1]。 成長因子の登場は.受動的治療から能動的治療への転換により.治癒困難な慢性創傷の治療に希望をもたらしましたが.成長因子の局所適用は.創傷の微小環境に影響され.失活が早く作用時間が短いため期待する治療効果が得られにくく.投与経路.剤形.経済的負担にも限界があります。
1990年代以降.国内外の一部の学者は.多血小板血漿（PRP）が高濃度の成長因子を含むことを発見し.その後.一部の学者は.PRPが創傷治癒.骨形成.軟組織の修復を促進し.骨治癒を促進する明確な能力を持っており.創傷治癒時間を大幅に短縮でき.骨治療の質も向上させることを発見しています。 PRPは完全に自己由来であり.病気の感染や免疫拒絶がなく.作り方も簡単で.組織へのダメージも少ないため.臨床応用が期待されています[2]。 本論文では.PRPの調製.組成.応用.および展望について概説する。
1.多血小板血漿（Platelet-rich Plasma
Harkeら[1]は1977年に初めて血小板豊富血漿（PRP）を分離・調製し.心臓手術患者において心肺バイパス（CPB）中の血小板機能障害や術後出血を回避するために使用することに成功しました。 近年.自己PRPは心臓外科.口腔顎顔面外科.骨・軟部組織欠損の修復などに広く用いられ.満足のいく結果が得られています。
1.1 多血小板血漿の分離の原理
1.1.1 PRPの調製に現在用いられている主な方法は.血漿交換と遠心分離である。 血漿分離置換法は.多機能な医療用血液成分自動分離装置を用いて血小板成分のみを回収するもので.自動化が進み.調製したPRP血小板の純度や濃度が高いが.一般的に血液使用量が多い方（概ね150ml以上）や静脈循環路を確保して血小板を回収し.他の血液成分を輸血用に戻す必要がある場合に使用する方法である。 この装置は高価であるため.臨床現場での普及には限界があり.現在は主に血液バンクで成分輸血用の血小板を採取するために使用されています。
遠心分離によるPRP調製の原理は.血液の各成分の沈降係数が異なり.1回の遠心分離で血液を3層に分け.下層は沈降係数の最も大きい赤血球層.上層は血清層.接合部には薄い層（肉眼では容易に見えない）.すなわち血小板豊富層があり.1回の遠心の後上清層または赤血球層を廃棄し.遠心力を変えて再度遠心を行い.多くの血小板を分離させるものです。 より多くの血小板が分離される。 遠心分離法は.通常.血小板の急激な沈降を避けるために1回目の遠心分離は低い力で行い.血小板の短時間での完全な沈降を促すために2回目の遠心分離を高い力で行う。 血小板は界面付近に最も多く存在し.界面下の赤血球層lmmを保持することで血小板の獲得が大幅に向上し.血小板の枯渇が抑えられることが実証されています。
Landesbergら[2]は.250gを超える遠心分離は血小板の過剰な破壊をもたらすが.1回の遠心分離時間＜5分で得られたPRPの血小板濃度は全血と有意差はないとし.1回の遠心分離後に赤血球層を廃棄し.再度200g.10分の遠心をすることが推奨されるとしている。 Marxら[3]は.1回の遠心分離で界面から2mm下の赤血球層で血小板濃度が最も高くなり.上澄み液を捨てて再度低速で遠心分離すると血小板の抽出が良くなることを見出した。 しかし.上清全体を低速で遠心分離し.接合層以下の赤血球の一部を別のチューブに入れ.高速で遠心分離する修正アペル法［4］が.より高い血小板回収率をもたらすと考える学者がほとんどである。
1.1.2 PRP中の血小板濃度は全血の16倍にもなり [5] .主に血小板由来成長因子（PDGF）.トランスフォーミング成長因子（TGF?β）.血管内皮成長因子（VEGF）.インシュリン様成長因子（IGF）.上皮成長因子（EGF）などの成長因子が高濃度に含まれています。 PRP中のPDGF.TGF?β.VEGF.EGFの濃度は.酵素結合免疫吸着法で確認したところ.生体内の正常濃度の3～8倍であった[6]。 また.PRP内の繊維状ネットワークは.細胞の接着を促進し.細胞の損失を防ぐ役割を担っています。
1.1.3 現在.PRPを用いた成長因子が臨床で成功しているが.それは患者自身のPRPである。患者が血液を分離しすぎると.貧血になったり.体の健康に影響を与える可能性がある。 この限界を克服するために.HUANG Qian [7]は.同種PRPから成長因子を分離することを考案しました。 その結果.PRPから分離した成長因子にはA.B.C.Dの4つの分画があり.その多くはBとCの分画に含まれ.効果的に細胞増殖を促進できること.真空凍結乾燥後に保存した分離成長因子は.本来の生物活性を維持できることが明らかになりました。
1.2 多血小板血漿ゲルの調製と活性化
PRPの分離の原理はともかく.臨床的にはPRPに塩化カルシウムとトロンビンを混ぜた粘性のあるゲル状の塊であるジェルの形で適用されることがほとんどである。 最も実績のあるPRP活性化剤は.10mg/ml塩化カルシウム溶液（血漿を凝固させるクエン酸阻害剤）と100U/ml牛トロンビン（フィブリンを不溶性のゲルに凝集させ.血小板脱顆粒を誘発し.メディエーターやサイトカインを放出する活性化剤）の混合物です。 使用前にPRPと活性剤を1：1の割合で混合し.空気を少し入れてよく振り.6～10秒後にPRPゲルを作り.傷口に均一に塗り.生体材料やガーゼで覆って.ゲルと傷口の接触時間を長くします。
最近.I. Martineauら[8]は.塩化カルシウムとトロンビンがPRP中の成長因子の放出.合成.分解を制御し.それぞれの成長因子が固有のパターンを持っていることを示しました。 PRP中の成長因子に対する塩化カルシウムとトロンビンの濃度の違いによる影響は大きく異なり.例えばEGF濃度はトロンビンの濃度が142.8U/mlのときに最も高く.IL-1濃度は塩化カルシウムの濃度が14.3mg/mlのときに最も高くなります。
1.3 多血小板血漿の作用機序
1.3.1 PRPの作用は.a粒子が活性化されて線維性網状足場を形成した後.その濃厚な血小板から高濃度の各種成長因子とフィブリノゲンが放出されることに依存する［9］。血小板由来成長因子（PDGF）.転送成長因子-β1β2（TGFβ1β2）.血管内皮成長因子（vEGF）.血小板由来内皮成長因子.インターロイキン?1（IGRF）などが含まれる。(IL?1).上皮成長因子(EGF).線維芽細胞成長因子.および血小板活性化因子[10]を含む。 これらの因子は組織の成長誘導に不可欠であり.フィブリノゲンが形成する線維性網状足場は.成長因子による新しい組織の産生誘導を支えているのです。 これらの因子は.骨芽細胞や前骨芽細胞の増殖促進.破骨細胞の形成と骨吸収の抑制.コラーゲン合成の増加.内皮細胞の増殖促進.新生血管の誘導.生体内の多くの種類の組織細胞の分裂と増殖の促進.マトリックス合成と沈着の促進.線維組織の生成促進などに不可欠な役割を果たしている。
1.3.2 PRPは.創傷治癒を促進するために活性化された成長因子を高濃度に含んでいる。 各成長因子の比率は.体内の通常の生理的濃度に近く.成長因子間の最適な相乗効果を可能にする [11]。 同時に，PPPは大量のフィブリンを含んでおり，修復細胞のための良好な足場を提供し，軟組織の再生を刺激し，早期の創傷閉鎖を促進し，感染を予防することができる[12]。 海外の学者の中には[13].大腸縫合後の裂孔圧の測定実験を通じてPRPも炎症の発生を抑える重要な役割を果たすことを発見し.最近の研究では.この効果のメカニズムがPRP中のマクロファージがIL?1特有の原始抑制因子を放出して初期炎症の発生を抑制することだと確認されています[14]。
1.3.3 PRPゲルは.血小板の消失を防ぎ.血小板が局所的に長期間にわたって成長因子を分泌することができる。 これらの外来成長因子は.（1）炎症細胞や組織修復細胞を走化させ.傷の殺菌とその後の修復の条件を整える走化剤として働く.（2）組織修復細胞上の成長因子受容体に直接働き.分裂促進作用により細胞周期移行を促進し傷の修復を促す.（3）組織修復細胞上の成長因子受容体に直接作用し.傷の修復を促す。 (2) 組織修復細胞上の成長因子受容体に直接作用して細胞周期移行を促進し.分裂促進作用により創傷修復を促進する.(3) 組織修復細胞上で発現上昇した成長因子受容体活性を活性化してシグナル伝達を促進する [15]．
また.PRPは高濃度の血小板を含むだけでなく.通常の環境下では生理的なレベルで維持されている凝固因子も豊富に含んでいます。 活性化された血小板に含まれる多くのタンパク質は.血小板が凝固してから10分以内にこれらのタンパク質を活性化するため.治癒過程を促進する効果があり.臨床的には治癒までの時間を短縮することができるのです。
2.慢性難治性創傷の治癒における多血小板血漿の役割
創傷治癒は.無傷の組織再生に対する特異的な宿主免疫反応であり.創傷では成長因子活性が変化すること.すなわち合成が減少し分解と不活性化が増加することが実験的に証明されている[16]。 PRPの局所投与により.外傷性出血部位に血小板と低温沈殿物の混合物を獲得し.外来性成長因子を増加させることができる。
2.1 現在の研究では.PDGFは移動性細胞の増殖を促進し.また細胞マトリックス産物を増加させることにより作用し.肉芽組織の迅速な形成に寄与することが確認されている。 PDGF mRNAは創傷面の線維芽細胞や角化細胞に発現していることから.PDGFは創傷線維芽細胞や炎症細胞の浸潤を促進し.損傷後期に線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行を誘導し.創傷組織でのコラーゲン合成を増加させて肉芽組織の増殖を促します。
ヒトのTGF?βには3つのアイソフォーム.すなわちTGF?β1?3があり.それぞれ生体内での空間分布や損傷後の時間分布が異なっていることが知られています。 組織外傷後の炎症前段階では.局所的に関連するサイトカインが増加する一方.TGF?βレベルが一時的に低下し.コラーゲン沈着が減少することが示されています。 活性化された血小板はTGF?βを産生し.細胞の分化.増殖.炎症プロセスに刺激を与え.細胞外マトリックスの合成とリモデリングに独自の役割を果たす。 TGF?βは線維芽細胞の走化性を促進してコラーゲン線維と細胞外マトリックスを生成するだけでなく.コラゲナーゼ合成の低下とメタロプロテイナーゼ阻害物質の生成を増加させて.傷口での酵素分解を抑制しており 創傷治癒を促進する。 実験的には.創傷モデルへの外因性TGF?βの注入は.線維芽細胞を活性化し.コラーゲン線維の生成を刺激し.創傷治癒を促進することができ.TGF?β1およびTGF?β2も創傷治癒張力を高めることができる[17]。
EGFは受容体に結合して活性化する。 EGF受容体はほとんど全ての細胞に発現しているが.表皮細胞に最も多く存在する。 EGFは表皮の成長を促進するだけでなく.マトリックス形成や結合組織の収縮を促進する効果もあります。 EGFの局所投与は.動物の切除創傷モデルにおいて.表皮の成長を促進し.創傷治癒の張力を増加させることが示されている。 rhbFGFは修復の初期から中期にかけて肉芽組織の生成を促進し.rhEGFは修復の中期から後期にかけて創傷の上皮化を促進する[18]。
IGFにはIGF?1とIGF?2があり.そのうち創傷修復におけるIGF?1の役割がより研究されている。PRP中の高濃度のIGF?1は.放出されると血管内皮細胞へのトロピズムとなり.血管内皮細胞を外傷部位に移動させ新血管の形成を促進できる。 またIGF?1によって多くの細胞.例えば線維芽細胞.骨細胞および 軟骨細胞 さらに.IGF?1はPDGFと相乗的に作用し.表皮および内皮の再生を促進することができる。
VEGFには.VEGFA.B.C.D.E.胎盤増殖因子が含まれます。 vEGFAは.内皮細胞表面の受容体VEGFR1およびVEGFR2と結合し.内皮細胞によるNO合成を促進し.血管新生を活性化する。また.内皮細胞の分裂を促進する。vegfcは.主にリンパ管内皮細胞のVEGFR3受容体に結合するが VEGFCは.主にリンパ管内皮細胞のVEGFR3受容体に結合するが.VEGFR2にも結合する。 VEGFDは.血管とリンパ管の両方の新生物を促進するという点で.VEGFCと類似しています。
2.2 実験および臨床研究において.PRPは治癒困難な傷の修復を促進する良好な効果を示している。PRPを使用して馬の子牛の傷を修復した実験で.カーターはPRPの修復効果が対照群よりも著しく優れていることを発見し.PRPの大量の成長因子が馬の子牛の傷の成長因子不足を補って.より迅速に修復メカニズムを開始し.上皮組織を形成して血管再生を促進し.傷修復に優れた環境を提供していると結論づけた。 その結果.PRPは創傷修復のためのより良い環境と血液供給を提供することが判明しました。 また.PRP投与群では.傷の瘢痕化が少ないことが実験で明らかになりました。これは.PRPに含まれる白血球や単球が多く.傷での炎症反応を抑制し.結果として瘢痕化が少なくなったためと思われます[19]。
しかし.馬の遠位前肢の傷の修復にPRPを用いた実験で.Monteiro [20] は.PRPは小さな傷にはあまり効果がなく.大きな組織欠損の治療に適していること.また.創傷組織学.TGFβ1測定.生体材料の評価.コラーゲンIおよびIII mRNAの検出により慢性傷の治療のための新しい道と見なされることを見いだしました。 Crovetti [16]は，皮膚潰瘍をPRPで治療し，PRPは対照群と比較して創傷部位に肉芽組織を形成する能力が高く，創傷上皮組織の完全再生を促すことを見出した．PRPによる複数の成長因子の局所放出は，創傷回復を促すために組み合わされる．例えば，創傷の炎症反応を媒介する好中球および単球に対するTGFβの化学動員効果，繊維芽細胞の増殖と分化を促すPDGF，および新しい細胞系の開発であった． PDGFは線維芽細胞の増殖・分化を促し組織のリモデリングを促進し.VEGFは血管再生を促進しますが.治療した患者さんが対照群と比較して有意に痛みが軽減されるかどうかは証明されていません。
Lee [21] らは.ウサギの皮膚全欠損の治療における PRP の促進効果を研究・評価した。 その結果.PRPは上皮の移動と血管新生反応を促進し.外傷部位を減少させることで皮膚全体を治癒することが示された。また.PRPの治療間隔を変えることで治療時間を変更することができることも示唆された Hom [22] らは.真皮全層欠損の創傷の治療にPRPを用いた前向き研究を行い.PRP群は抗生物質軟膏群および半露光療法群よりも治癒が早く.瘢痕の成長も少なかったことを示した。
GUOら[23]は.下肢の慢性難治性創傷47例（いずれも2～4ヶ月の治療で治癒せず）の臨床観察を行った。創傷を取り除き.自己PRPジェルを2ヶ月ごとに1～2回注入し.4ヶ月間追跡したところ.2ヶ月後には軟組織循環が著しく改善し.肉芽組織が広範囲に増殖した；4ヶ月後には創傷治癒率が79.3％より高く.統計的に有意だった。 4ヶ月後の治癒率は79.3％と高く.統計学的に有意であった。 Marquezら[24]は.目の化学熱傷患者10人に自己PRPを適用し.治療群にはPRPの結膜下注射を.対照群には従来の方法を適用した。 また.細胞の増殖や分化を促進し.傷の治癒を促進する効果も期待できます。
3.多血小板血漿の開発における利点と問題点
3.1 自己血から全血を遠心分離して得られる血小板濃縮物であるPRPの現在の臨床利用は.近年.多くの学術的注目を浴びている。 第一に.PRPは自己由来であるため.免疫拒絶反応.疾患伝播.外因性成長因子によるヒトの遺伝子構造の変化の可能性といった懸念に根本的に対処し.回避することができることです。 第二に.PRPは調製が簡単で早く.方法も比較的成熟しており.検査方法も標準化されており.調製の品質が保証されていることである。 第三に.PRPには高濃度の各種成長因子が含まれており.各成長因子の比率は体内の正常な比率に近く.相乗効果が最も優れているため.単一成長因子療法の欠点をある程度補うことができます。 第四に.PRPをトロンビンでゲル状に凝固させることができる。 ゲル状のPRPは組織欠損部を結合するだけでなく.血小板の消失を防ぎ.局所的に長時間.成長因子を分泌し.高濃度の成長因子を維持することが可能である。 5つ目は.PRP調製は患者さんへのダメージが少なく.患者さんの静脈から採血するだけでよいことです。 海外では.まず静脈から血液を採取し.高濃度の血小板を抽出した後.残りの血液成分を体内に戻すことができる専用のPRP製造機が作られるようになり.この方法は低コストで医療費の削減が期待できる。 6つ目は.PRPの身体への悪影響は今のところ確認されていないことです。
3.2 PRPの欠点は.その臨床応用の普及を大きく制限するものである。
(1) オープンシステムで調製し.複数の容器で移送するため.外部からの汚染に対して脆弱である。
(2) 血小板は.長時間の採血.細い針.止血帯の装着.不適切な抗凝固剤やリザーバー.振とうの程度.装着時間などの外来刺激により.in vitroで破壊されたり活性化したりしやすく.これらはすべて人為的に血小板活性化を引き起こす可能性がある。
(3) 血小板と成長因子濃度の関係は複雑であり.製造工程における様々な要因に影響されるほか.血小板の活性化様式（クライオ活性化.トロンビン活性化）.活性化の程度.成長因子測定キットの感度によって変化する可能性があること。
(4) 生体内の血小板とその成長因子の寿命は5日を超えず.PRPがトロンビンやカルシウムイオンで活性化されてゲルブロックを形成しても.ゲルブロックからの血小板内容物（成長因子含む）の連続放出は約1週間であり.組織修復の全過程に作用するとは考え難い。
3.3 もちろん.今後取り組むべき課題は.次のようにたくさんあります。
(1) PRPの効率的かつ安定的な製造方法のさらなる確立.異なる方法と活性剤濃度で製造したPRPが分泌する成長因子の生物学的特性の研究.生体内PRPゲルが分泌する成長因子と各種成長因子間の相互作用の解明.創傷修復におけるPRPの最適治療濃度・治療時間の決定。
(2) 同種PRPからの成長因子の単離が広く注目されており.理論的にはこの方法は免疫原性を低下させ.免疫拒絶を防ぐことができるが.これを確認するためにはさらなる研究が必要である [7]; (30) 異なる臨床使用条件に適応する.異なるPRP製品に関する研究.および生産技術プロセスと製品安全性の問題を特定すること [25] 。 PRPの継続的な研究とともに.PRPの応用はより広く.より便利になると考えられています。