ヒト妊娠初期の絨毛と脱皮組織における細胞アポトーシスとシグナル伝達に対する公慶顆粒の効果を調べ.薬による中絶後の子宮異常出血（薬による中絶後出血と呼ぶ）の臨床的予防と治療の生物学的基礎を提供すること。 方法：被験者120名を無作為に公青薬物中絶群.西子薬物中絶群.単純薬物中絶群.陰圧吸引群に各30例ずつ分け.各群の絨毛と脱皮組織を採取して細胞の超微細構造変化を観察し.アポトーシス率（AR）をTUNEL法で検出し.細胞内カルシウムイオン濃度（[Ca2+]i）（Ca2+）（i）（Ca2+）（ii）（iii）（Ca2+）を蛍光分光光度計で測定し.プロテインキナーゼC（PKC）（PKC）（PKC）のタンパク質発現を免疫組織化学で測定した。 プロテインキナーゼC（PKC）は免疫組織化学で検出した。
結果：宮城流産群の絨毛膜絨毛とメコン組織細胞の超微細構造は典型的なアポトーシス変化を示し.ARと[Ca2+]iは増加し.PKCタンパク質発現は減少し.これらは他の3群と比較して統計学的に有意であった（P<0.05またはP<0.01）。
結論：公清顆粒は.細胞内Ca2+およびPKCを介した細胞シグナル伝達に影響を与え.ヒト妊娠初期の絨毛および斑状組織細胞のアポトーシスを誘導し.絨毛および斑状組織の完全な排出を促進し.薬物中絶後の出血を予防および制御することができる。
薬による中絶は安全で痛みが少ないという利点がありますが.出血時間が長い.出血量が多いなどの問題があります。 漢方薬の公慶顆粒の処方は.長い間臨床で使用されてきた効果的な処方であり.国家薬品監督管理局の新薬臨床研究の承認を受け.第二相臨床試験を成功裏に終了しました。 本研究では.アポトーシスとシグナル伝達の観点から.公清顆粒の分娩後出血の予防と制御のメカニズムを検討し.臨床応用のための生物学的根拠を提供するとともに.漢方における「分娩後虚血」理論の科学的意味合いを豊かにすることを目的とした。
データと方法
I. 対象者
2006年5月から2007年10月までに山東中医薬大学附属病院の婦人科クリニックに通院した120名で.中国産科婦人科学.産科婦人科診断治療ルーチン.新中医薬臨床研究ガイドラインの関連内容に従って対象者と除外者を決定した。 <ミフェプリストン（中国国家薬品標準H20000628.バッチ番号050501）とミソプロストール（中国国家薬品標準H10960144.バッチ番号050309）は.上海華聯医薬有限公司（国家薬品監督管理局臨床薬物管理所）によって製造されました。 Ltd.が製造したものである（国家薬品監督管理局新薬臨床研究認可2003L01386）。
A群：ミフェプリストンとミソプロストールを通常の薬による中絶方法に従って服用。
B群：中絶1日目にミフェプリストンとミソプロストールを15カプセル/日.3回に分けて連続3日間服用しました。
C群：通常の薬による中絶の方法でミフェプリストンとミソプロストールを服用し.漢方薬は使用しませんでした。
D群：通常の薬による中絶の方法と同じ方法でミフェプリストンとミソプロストールを服用し.漢方薬は使用しませんでした。
4.D群：陰圧吸引による中絶。
4.組織学的分析
1.材料の採取 A.B.C群から排出された新鮮な絨毛30例とメコニウム組織20例.D群の手術中に得られた絨毛とメコニウム組織30例を採取し.これらの組織を直ちに生理食塩水で洗浄し.定法により固定した。
2.透過型電子顕微鏡による細胞超微細構造の観察 細胞をエポキシ樹脂（812）に包埋し.超薄型ミクロトームで約60nmの厚さにスライスし.酢酸ウラニルとクエン酸鉛の二重染色を行った後.JEM-1200EXの透過型電子顕微鏡で観察し.写真撮影を行った。
3.細胞AR検出のためのTUNEL法 HE染色後.標本を脱脂し.プロテイナーゼKと室温で20分間インキュベートした。50μlのTUNEL反応混合物を滴下添加し.ウェットボックス内で37℃で60分間インキュベートした。50μlの形質転換剤PODを添加し.37℃で30分間インキュベートした後.スライスを脱水.透明化し.DABクロマトグラフィーでブロックし.ヘマトキシリン核再染色した。 以上の工程をすべてPBSで洗浄し.陰性対照はterminal deoxynucleotidyl transferaseを含まないTUNEL反応液でインキュベートした。 定量的画像解析：TUNEL陽性反応物は核に局在し.茶色がかった黄色で現れ.色陽性細胞はアポトーシス細胞であった[6]。 蛍光分光光度計による[Ca2+]の検出 i 日立蛍光分光光度計F-4500を用い.励起グレーティングを5 nm.発光グレーティングを10 nm.測定温度を37 ℃に設定した。 Fura-2/AM標準溶液およびローディング溶液の励起スペクトルを分光測定したところ.その極大波長は380 nmから340 nmに減少し.Fura-2/AMローディングが細胞内に入ったことが示された。 Fu-ra-2ローディング溶液の蛍光強度（F値）は.終濃度0.1%の10% TritonX-100を添加して経時的に測定し（励起波長340 nm）.30分後に最大蛍光強度Fmaxを検出し.終濃度5 mmol/,lのEDTAを添加して30分後に最小蛍光強度Fminを測定した。 nmol/L)=Kd(F-Fmin/Fmas-F), KdはFura-2とCa2+の反応の解離定数で.37℃で224nmol/Lである。
5.細胞性PKCのタンパク質発現の変化を検出するための免疫組織化学 標本切片を脱パラフィンし.3％HOと室温で10分間インキュベートした。 水洗後.西洋ワサビ酵素標識二次抗体を滴下し.37℃で30分間インキュベートした。 結果はLeica QWのV3画像解析ソフトで解析され.タンパク質発現強度とグレースケールの大きさには負の相関があった。
V. 統計方法
SPSS12.0統計ソフトを使用し.測定データは平均値±標準偏差（±s）で表し.まず分散カイ二乗検定を用い.群間差の比較にはq検定と順位和検定を用い.計数データにはx2検定を用いた。
結果
I. 一般情報
統計解析の結果.年齢.受胎可能期間.閉経日数.妊娠嚢の大きさの4群間の差は統計的に有意ではなく.同等であった。
2.絨毛と変成細胞の超微細構造観察（図省略）
1.D群では.絨毛絨毛細胞と変成細胞の表面は微絨毛が豊富で.絨毛絨毛細胞の基底膜は正常であった。絨毛絨毛細胞と変成細胞の核の形態は正常で.核内のクロマチンは均一に分布し.オルガネラも正常であった。顆粒膜細胞には電子密度の高い分泌粒子が多数存在し.細胞間の結合は緊密であった。
2.C群では.絨毛細胞および中分化期細胞表面の微絨毛が剥離し.絨毛細胞の基底膜が肥厚し.絨毛細胞および中分化期細胞の核の形態が不規則で.核膜が膨張し.ユークロマチンの塊化.ヘテロクロマチンの境界線.核の凝縮などのアポトーシス変化がみられた。 顆粒膜細胞は内分泌顆粒の数が著しく減少し.細胞間結合が広がっていた。
3.B群の合胞体栄養芽細胞.細胞栄養芽細胞.分裂中期細胞.顆粒膜細胞の超微細構造の変化は.C群と同様であった。
4.
4.A群ではアポトーシスの形態学的変化がC群.B群よりも激しく.基本的に正常な構造を持つオルガネラを含む典型的なアポトーシス小胞が.合胞体栄養芽細胞.細胞栄養芽細胞.エクジステロイド.顆粒膜細胞に出現した。
AR.[Ca2+] iおよびPKCの変化
A群の絨毛絨毛細胞およびメタフェース細胞のARおよび[Ca2+] iは上昇し.絨毛細胞およびメタフェース細胞のPKCのグレイ値は上昇し.その差は他の3群と比較して統計学的に有意であった（P<0.05）。
表1 クロマフィン絨毛細胞におけるAR.[Ca2+]iおよびPKCの変化（
±s）
グループ
症例数
AR(%)
[Ca2+]i
PKCグレイ値
グループA
30
3.02±0.20*▲△
125.37±6.40*▲△
135.71±3.82*▲△
グループB
30
2.89±0.19*
120.33±7.58*
133.73±3.81*
グループC
30
2.87±0.21*
119.91 ±6.80*
133.17±3.70*
D群
30
2.17±0.23
109.03±7.84
127.51±3.73
*D群との比較P<0.01 ▲C群との比較P<0.05 △B群との比較P<0.05 ▲C群との比較ΔP<0.05 表2 十二指腸組織細胞のAR.[Ca2+] iおよびPKCの変化（
±s）
群
症例
AR（%）
[Ca2+] i
PKCグレースケール値
群A
20
3.13 ±0.18*▲△
130.65±7.46*▲△
142.80±4.93*▲△
グループB
20
3.02±0.14*
125.14±8.04*
139.17±4.94*
グループC
20
2.99±0.19*
124.42±7.96*
138.25±5.18*
D群
30
2.83±0.15
110.31±7.53
131.45±4.03
*P<0.01 vs. D群 ▲P<0.05 vs. C群 0.05 △BP群と比較<0.05
考察
近年.薬による中絶後の異常な子宮出血は.絨毛膜絨毛細胞や脱皮細胞のアポトーシスの欠如に関係していると考えられており.ミフェプリストン作用後の絨毛膜絨毛細胞や脱皮組織の細胞はアポトーシス傾向を示し.本研究の結果はその報告と一致している。 漢方薬がアポトーシスを調節すること.血液循環を活性化し.瘀血を取り除くことがアポトーシスを誘導し.細胞増殖とアポトーシスのバランスを調節すること.清熱薬と強壮薬が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することは証明されているが.漢方薬が妊娠初期の絨毛と脱皮組織細胞のアポトーシスを誘導し.薬物流産後の出血を予防するという研究報告はまだない。
この作用のメカニズムをさらに探るために.私たちはセカンドメッセンジャーであるCa2+とその重要な標的タンパク質であるPKCについて研究しました。
Ca2+は様々な細胞内シグナル伝達経路のハブであり.[Ca2+]iの上昇がアポトーシスを引き起こすという証拠がある。 近年.薬物中止細胞におけるアポトーシスの研究は深化しているが.アポトーシスのシグナル伝達に関与する重要な因子であるCa2+過負荷の研究は報告されていない。 今回初めて[Ca2+]iをアポトーシスに及ぼす堕胎薬の影響の研究に組み入れたところ.絨毛および真珠腫の[Ca2+]iが公清顆粒により上昇することが明らかとなり.公清顆粒がCa2+を介したシグナル伝達に影響を与えることにより.ヒト妊娠初期の絨毛および真珠腫のアポトーシスを誘導する可能性が示唆された。 シグナル伝達経路において.PKCは細胞内Ca2+作用の重要な標的タンパク質であり.細胞の増殖.分化.アポトーシスに重要な役割を果たしている。
PKCの活性化は.標的タンパク質分子のセリン／スレオニン残基をリン酸化することにより.様々な生物学的作用を媒介する。 リン酸化によるGタンパク質の活性化のダウンレギュレーションや.環状アデノシン一リン酸（cAMP）レベルの上昇を引き起こし.アポトーシス細胞死を誘導する。 また.PKCの活性化により細胞内のcAMPレベルが上昇し.細胞の増殖や分化につながる転写が促進されることも報告されている。 ミフェプリストンは.妊娠初期の絨毛細胞において.PKCシグナル伝達経路とraf-1ウォーターフォールキナーゼ鎖および分裂活性化タンパク質を阻害し.増殖と分裂を抑制し.アポトーシスを誘導することが明らかになった。 本研究では.薬物中絶後に絨毛性絨毛芽細胞およびメタフェースの組織細胞におけるPKCタンパク質の発現が減少することを発見し.公清血漿の使用はPKCタンパク質の発現を減少させることにより.細胞の分化と付加価値を阻害し.アポトーシスを誘導する可能性が示唆された。
中医学では.薬による中絶は人為的な妊娠の終了であり.薬による中絶の後.陰血が急に不足し.気が血を取り込まなかったり.胎児が不完全で.残留血が子宮内に停滞し.うっ血が消えず.新しい血が定着しにくかったり.外邪が襲ってきて熱となり.熱が血を傷つけたり.3つが絡み合って.虚実が併存し.邪露がきれいにならなかったりすると考えます。 「瘀血.虚熱」はこの病気の主なメカニズムであり.瘀血を取り除くために血液循環を活性化させることがこの病気を治療する鍵であり.血液循環は瘀血を取り除くことによって行うことができ.血を養い気を益することがこの病気を治療する基本である。
「子宮清血丸」は血液の循環を活発にし.瘀血を取り除き.熱を取り除き.出血を止めるために使用されます。アマランサス.キキョウ.ブクリョウの主薬は血液の循環を活発にし.瘀血を取り除き.血液を冷やし.出血を止めるのに役立ちます。アンジェリカ・シネンシス.コドノプシス・ピロスラの補助薬は血液を養い.生命エネルギーを益して血液の循環を促進し.瘀血を取り除きます。
この処方は.ヒトの妊娠初期の絨毛絨毛と脱皮組織細胞のアポトーシスを誘導し.絨毛絨毛と脱皮組織の完全な排出を促進し.薬による中絶後の出血を予防・制御できることがわかりました。 Ca2+およびPKCを介した細胞内シグナルの調節は.その作用機序の一つであると考えられる。 しかし.絨毛や脱落組織のアポトーシスを誘導する細胞内Ca2+の供給源とその正確なメカニズムはまだ明らかにされておらず.この方向での詳細な研究により.この疾患の病態と薬剤による予防と治療のメカニズムがさらに明らかになると思われる。