亀爪煎じ薬は.東漢時代の医師である張仲景が著した「金匱要略」に収載されており.瘀血を断ち.痰を解消し.Yを解消する薬である。 肝臓がん.食道がん.白血病.子宮筋腫などの治療に有効であることが報告されています。 亀の爪煎じ薬の成分は.血を分解し.瘀血を解消し.節を分散させる製品で構成されています。 これらの破血.瘀血.結節散が腫瘍にどのような影響を与えるのか.腫瘍の血管新生や腫瘍の転移を促進するのか.真剣に検討する価値があると思います。 我々は.腫瘍担持マウス動物モデルの確立にin vivoハーブ介入を行い.腫瘍担持マウスの腫瘍塊における微小血管数（MDC）.血管内皮増殖因子（VEGF）.増殖細胞核抗原（PCNA）の発現を観察し.腫瘍血管系に対する亀甲煎じ薬の効果を説明しました。
1.材料と方法
1.1 実験動物：広州中医薬大学動物センターから購入した60匹の昆明種マウス.4～6週齢.体重18～22g.雄。 マウスは別々のケージに入れ.餌と水を自由に与え.ラット室は換気された状態に保たれた。
1.2 細胞株：細胞株は.皮下接種で肉腫ができるマウス腹水型肝細胞癌細胞株H22細胞を使用した。 この細胞は.孫文大学医学部腫瘍学研究所から購入し.日常的に蘇生と継代を行った。
1.3 主な試薬：PCNA一次抗体.VEGF一次抗体およびキット.すべてWuhan PhD Biological Engineering Co.より入手。
1.4 薬剤の調製：亀甲煎じ薬.杭州胡青玉湯有限公司製。 亀の甲羅の煎じ薬を蒸留水で調製し.高用量群および低用量群それぞれ1mlあたり0.048gおよび0.024gの原薬を含む2種類の懸濁液とし.冷蔵庫で4℃保存し.使用時にはよく振盪した。 シクロホスファミド.江蘇恒瑞医薬有限公司製.バッチ番号02071121 シクロホスファミドを滅菌生理食塩水で2mg/mlに希釈し.4℃の冷蔵庫で保存する。
1.5 ホメオパシー・マウスモデルの確立 [1]: 培養H22細胞の体外蘇生：通常通り細胞懸濁液を作成する。 2-3×106/mlの腫瘍細胞に調整し.健康な昆明種のマウス10匹を無作為に選び.それぞれに上記細胞懸濁液を0.4mlずつ腹腔内注射し.約1週間後に接種したマウスの腹部が明らかに拡大し突出した。 合計44匹のマウスに0.2mlの腫瘍細胞懸濁液を接種し.24時間後に薬物を投与した。
1.6 実験グループ分けと投与：正常に成型された44匹のマウスを11匹ずつ4グループにランダムに分け.グループ内で番号を付けた。4グループは.亀甲煎じ薬高用量グループ.亀甲煎じ薬低用量グループ.陰性コントロールグループ.シクロホスファミドグループである。 治療はすべて成型2日目から開始した。高用量群と低用量群にはそれぞれ12g?kg-1?d-1と6g?kg-1?d-1の亀甲煎じ薬を経口投与し.陰性対照群には同量の蒸留水を経口投与し.シクロホスファミド群には腹腔内注射で20mg?kg-1?d-1を与えた [2 -1腹腔内注射を行った[2]。 15日間の連続投与後.腫瘍を中止し.マウスを処刑し.腫瘍塊を剥離し.10％ホルムアルデヒドで固定した。
1.7 摘出物の処理：固定.脱水.ワックスディッピング.ワックスラッピング.切片化などを含む。
1.8 結果の判定：腫瘍内の微小血管数（MDC）：各腫瘍保有マウスの腫瘍内の異なる5箇所で採取し.腫瘍の出血領域と辺縁反応領域を除いた各ブロック5mm×5mm×2mmとする。 大きな血管からの干渉を避けるため.厚い平滑筋壁を持つ血管や8赤血球の内腔部はカウントしなかった。 その平均値をこの場合の腫瘍のMDC値とする[3]。
PCNAは茶黄色または茶褐色の核の有無で判定し.各検体について高倍率10視野をランダムに観察し.各高倍率視野の腫瘍細胞100個中の陽性細胞数をカウントします。 腫瘍細胞の総面積に対する陽性面積の割合を表した。
2 , 結果
2.1 腫瘍組織の微小血管数（MDC）に対する亀甲煎じ薬の効果
表1に示すように：陰性群と比較して.亀甲煎じ薬高用量群.亀甲煎じ薬低用量群の両方のMDCは有意に低い（P0.01）。 一方.シクロホスファミド投与群と陰性対照群のMDCには有意差はなかった（P>0.05）。 亀の子煎じ薬高用量群のMDCは.亀の子煎じ薬低用量群のMDCより有意に低かった（P0.01）。 また.亀の子煎じ薬高用量群.亀の子煎じ薬低用量群ともにMDCは有意に低く.シクロホスファミド群と比較して有意差があった（P0.01）。
表1 腫瘍組織の微小血管密度（MDC）に対する亀の甲煎じ薬の効果 ( )
グループ
n
開始
用量
(g/kg)
MDC
(bars)
負のコントロール群
11 11
–
シクロホスファミド群
11 11
20
14.6±2.2
亀の子煎じ薬高用量群
11
12
4.1±1.2*▲△
亀の子煎じ薬少量群
11
6
7.6±1.2*▲△
注：陰性対照群との比較：*P0.01.亀の甲煎じ薬低用量群との比較：▲P0.01.
シクロホスファミド群との比較：△P0.01
2.2 VEGF（血管内皮増殖因子）の腫瘍組織への影響
VEGFの発現量は亀の甲煎じ薬高用量群と低用量群の両方で陰性対照群と比較して著しく弱かった。 高用量群.低用量群ともに陰性対照群より有意に弱かった（P0.01）。 VEGFの発現は.亀の甲煎じ薬高用量群および亀の甲煎じ薬低用量群で.シクロホスファミド群と比較して有意に弱かった（それぞれP0.01, P0.05 ）。 また.VEGFの発現も亀の甲煎じ薬高用量群は亀の甲煎じ薬低用量群に比べ有意に弱まった（P0.01）。 結果を表2に示す：
表2 腫瘍組織の血管内皮増殖因子（VEGF）に対する亀甲煎じ薬の効果 ( )
グループ
n
開始
投与
(g/kg)
VEGF
(%)
負のコントロールグループ
11 11
–
13.18±1.47
シクロホスファミド群
11 11
20
9.18±3.40*
亀甲煎じ薬高用量群
11 11
12
2.36±1.12*△▲
亀甲煎じ薬低量群
11 11
6
5.91±1.38*△
注：陰性コントロール群との比較：*P0.01.シクロホスファミド群との比較：△P0.05 , △△P0.01;
亀の甲煎じ薬低用量群との比較：▲P0.01
2.3 PCNA（増殖細胞核抗原）の腫瘍組織に対する影響 腫瘍組織増殖細胞核抗原（PCNA）に対する亀の子煎じ薬の効果
表3に示すように.PCNAの発現は.陰性対照群と比較して.亀の子煎じ薬高用量群と亀の子煎じ薬低用量群の双方で有意に弱まった（P0.01）。 シクロホスファミド投与群と比較して.PCNAの発現は.亀の甲煎じ薬高用量群.亀の甲煎じ薬低用量群ともに有意に弱まった（P0.01)。 PCNAの発現は.亀の甲煎じ薬高用量群では亀の甲煎じ薬低用量群より有意に弱かった（P0.01)。
表3 腫瘍組織の増殖核抗原（PCNA）に対する亀の甲煎じ薬の効果 ( )
グループ
n
開始
投与
(g/kg)
PCNA
(%)
負のコントロールグループ
11 11
–
57.45±2.16
シクロホスファミド群
11 11
20
34.18±2.64*
亀甲煎じ薬高用量群
11 11
12
12.90±4.16*△▲
亀甲煎じ薬低量群
11
6
腫瘍の成長.浸潤.転移には.新生毛細血管網のサポートが必要である。 悪性腫瘍細胞は.急速かつ無限に成長するために必要な栄養素と酸素を適時に受け取り.代謝産物を輸送するために.新しい毛細血管の豊富なネットワークに依存しています。 成長の過程で.腫瘍は血管を侵食する物質を分泌し.新生血管を促進することがあります。
VEGFは内皮細胞に特異的に作用する多機能因子であり.腫瘍の血管新生の誘導と制御に重要です。vEGFは血管.特に微小血管の透過性を高め[5].血管新生の際に複数の細胞の移動のための線維性ネットワークを提供します。vEGFは選択的血管内皮細胞増殖促進因子であり.内皮細胞の増殖を直接刺激し[6] VEGFは.腫瘍の血管新生を反映し.腫瘍の生物学的異質性を決定する予後指標として使用されています。
本実験では.担癌マウスの腫瘍塊におけるVEGFの発現を免疫組織化学的に検出しました。 その結果.亀の甲煎じ薬の高用量群.低用量群ともに.VEGFの陽性率は陰性対照群に比べ有意に低いことがわかりました（P0.01）。 また.亀の子煎じ薬高用量群および亀の子煎じ薬低用量群では.シクロホスファミド群と比較して.VEGFの発現が有意に弱かった（それぞれP0.01.P0.05）。 また.高用量群と低用量群の間にも有意差があった（P0.01）。 このことから.この担癌マウスにおけるVEGFの発現は.亀の甲煎じ薬錠剤によって有意に抑制され.定量的な効果傾向が見られたことがわかりました。
血管が密になると.腫瘍細胞が循環に入る機会が増え.腫瘍細胞はこの血管を越えて離れた部位に転移しやすくなります[7]。 本実験では.亀の甲煎じ薬の高用量群.低用量群ともに微小血管数が有意に減少し.陰性対照群のMDCと有意な差を示しました（P0.01）。 一方.シクロホスファミド投与群のMDCは.陰性対照群と比較して有意な差は認められなかった（P>0.05）。 亀の甲煎じ薬高用量群のMDCは.亀の甲煎じ薬低用量群のMDCより有意に低かった（P0.01）。 このことから.亀の甲煎じ薬はハスマウスの腫瘍血管系を抑制する効果があることがわかりました。
PCNAは核内タンパク質であり.細胞増殖に伴って発現する。 細胞の増殖状態を評価する指標として.悪性腫瘍の研究に広く利用できるのは.このPCNAの生理的な働きによるものです。 悪性腫瘍組織におけるPCNA発現の検出は.腫瘍の悪性度の判定.リンパ節転移の傾向の予測.臨床治療プロトコルの指針.患者の予後改善に重要である[8]。 今回の実験では.担癌マウスの腫瘍組織におけるPCNAの発現を免疫組織化学で検出し.腫瘍組織におけるPCNAに対する景芳亀甲煎じ薬の効果を検討した。 その結果.亀の甲煎じ薬の高用量群及び低用量群におけるPCNAの発現は.陰性対照群に比べ有意に弱まり（P0.01）.シクロホスファミド群に比べ有意に弱まった（P0.01）。 また.高用量投与群におけるPCNAの発現は.低用量投与群に比べ有意に弱かった（P0.01）。 これらのことから.この担癌マウスにおけるPCNAの発現は.亀甲煎じ薬によって有意に抑制され.定量的な効果傾向が見られた。
4.結論
亀の甲煎じ薬は.腫瘍を有するマウスの腫瘍の微小血管数を有意に減少させることができ.これは亀の甲煎じ薬が腫瘍を有するマウスの腫瘍の血管新生を抑制することによって腫瘍抑制効果を達成できることを示しています。 亀の甲煎じ薬による腫瘍の血管新生の抑制は.腫瘍のVEGFの抑制によって達成されると考えられる。 亀の甲煎じ薬による腫瘍の血管新生の阻害は.腫瘍のVEGFの阻害によって達成される可能性がある。
本研究の結果は以下の通りです。