片肺換気（OLV）は，胸部手術のための特殊な人工呼吸法である。しかし，両肺を別々に換気でき，手術に便利な条件を提供する一方で，必然的にいくつかの有害事象を引き起こす。臨床麻酔では.OLVによる肺障害が注目されているが.OLVによる肺障害の病態は解明されていない。近年.肺組織傷害にはアポトーシスが重要な役割を果たしており.人工呼吸の初期に肺胞上皮細胞のアポトーシスの発生が示唆されている研究もあるが[1].OLV中の肺組織におけるアポトーシスに関する研究はほとんど報告されていない。本実験の目的は.OLV中の肺組織におけるアポトーシス指数およびアポトーシス実行因子Caspase-3の発現を調べ.その変化とOLVによる肺損傷との関係を解析することである。広西医科大学附属癌病院麻酔科 黄 冰
材料と方法
動物群 体重 200-250 g の健康な SD 系雄ラット 42 匹（広西医科大学実験動物センターより提供）。ラットはブランク対照群（C群）.複肺換気対照群（B群）.単肺換気群（A群）に分けられた。C群は自然呼吸群.A群とB群は3つのサブグループに分けられた：A1群（OLV0. 5h.換気再開0.5h）.A2群（OLV1h.換気再開0.5h）.A3群（OLV1.5h.換気再開0.5h）.B1群（複肺換気1h）.B2群（複肺換気1.5h）.B3群（複肺換気2h）である。ラットは無作為に割り付け.各群6匹.計7群にした。
モデル作成 A群ラットはケタミン80mg/kgで麻酔し.シメオンII 0.6~0.8ml/kgを筋肉内投与.気管切開し自家製気管チューブを主管に挿入.ベクロニウムブロミド2mg/kg投与.呼吸が弱くなったらベンチレーター（江湾型I小型動物ベンチレーター）を接続して機械換気とした。潮量（VT）．10ml/kg.呼吸数(RR): 60回/分。左側第5肋間で開胸し.左肺を露出させ.気管チューブを右気管支に深く挿入し.換気パラメーターを調整したVT：5-6ml/kg.RR：80回/分。B群では.左肺露出後.予定時刻まで両肺を換気した。
標本は.C群ラットでは麻酔後.速やかに頸動脈から排出したが.A群.B群では換気後.直ちに頸動脈から所定時間まで排出した。左肺下葉の残存組織を採取し.超低温冷蔵庫にて-80℃で保存し.検査に供した。
検出項目および方法 肺組織の形態および構造変化をHE染色光学顕微鏡で観察し.肺組織におけるCaspase-3タンパク質の発現をイムノブロッティングで検出し.フィルムスキャン後のウェスタンブロット反応タンパク質バンドの画像をイメージラボゲル画像解析システムで解析し.標的タンパク質バンド群および内部基準について各標的タンパク質バンドのグレイスケール値を算出し 内部基準GAPDHタンパク質バンドのグレイスケール値に対する.それぞれの標的タンパク質バンドのグレスケール値の比率を算出することにより算出した。肺組織のアポトーシス指標は.in situ end-labeling (TUNEL) 染色で検出した（各セクションについて重複していない 10 フィールドを選択し.陽性細胞は茶黄色の核で染色された。
統計解析 統計解析はSPSS13.0ソフトウェアパッケージによって行い.測定データは平均値±標準偏差（x(_)±s）で表した。サブグループ間の比較には一元配置分散分析を.グループ間の二元配置比較には LSD-t 検定を用いた。対応するサブグループ間の比較にはt検定を用いた；P < 0.05は統計的に有意な差とみなした。
結果
間質の肥厚は明らかであった。
TUNEL染色 C群の肺組織にはアポトーシス細胞は見られなかった。B群の肺組織には.換気2時間後に両肺で少数のアポトーシス細胞が見られた。アポトーシス指数はB3群に比べA3群で有意に高かった（P < 0.05）。
肺組織のCaspase-3タンパク質量 C群と比較して.A1群ではCaspase-3タンパク質量に大きな変化はなく（P＞0.05）.A2群.A3群で発現が増加し（P＜0.05）.換気時間の延長に伴いC群＝A1群＜A2群＜A3群（P＜0. 05）。B群のサブグループと比較して.A1群とB1群の差は統計的に有意ではなかった B群のサブグループと比較して.A1群とB1群の差は統計的に有意ではなかった（P＞0.05）.A2群とA3群の発現は対応するB2群とB3群と比較して増加した（P＜0.05）。
表1 ラット肺組織におけるアポトーシス指標とCaspase-3タンパク質発現量の群間比較（n=6,`x±s)
検出指数
グループC
グループA1
グループ A2
グループ A3
グループB1
グループB2
グループB3
AI(%)
0.12±0.08
0.13±0.08
6.17±0.75 ab
16.00±1.10 ab
0.15±0.10
0.18±0.08
4.83±0.75 a
カスパーゼ 3
0.21±0.02
0.22±0.02
0.34±0.01ab
0.69±0.01ab
0.22±0.01
0.23±0.01
0.28±0.01a
aP<0.05 C群と比較； bP
考察
特殊な機械換気としてのOLVは現在.胸部外科で広く用いられているが.非換気側の肺の血液の酸素化不足によるOLV中の静脈血混入は.肺組織の低酸素化を引き起こし.機能障害のみならず肺組織細胞傷害を引き起こす。萎縮後の肺の再緊張と再緊張換気中の過度の牽引は.一連の反応を引き起こし.悪化させ 実験結果は.OLVの延長に伴い.ラットの肺組織は徐々に肺胞構造の破壊.鬱血と浮腫.間質の漸増を示し.これは以前の研究結果と一致する[3]。
OLV による肺損傷には.機械的損傷や生物学的損傷など.様々な複合的な損傷機序が存在する。近年の多くの研究により.肺胞の構造破壊につながる肺組織細胞の過剰なアポトーシスを誘発し.肺胞毛細血管膜の損傷を悪化させることにより.急性肺損傷のプロセスに様々な要因が関与していることが示唆されている[4]。人工呼吸の研究では.主に気管支上皮細胞や肺胞上皮細胞が機械的牽引の刺激によりNF-κBの炎症カスケード反応を活性化してアポトーシスを促進すると考えられている[1]。本実験では.コントロール群の肺組織では換気2時間で少数のアポトーシスが見られた。一方.OLV群では.OLV時間の延長に伴い.ラットの肺胞内腔の脇腹に.0. 5 h の OLV 1h retension ではラットの肺胞内腔の内側に.0.5 h の OLV 1.5 h retension では間質に多くのアポトーシス細胞が見られ.これらの変化は同時期に比べ 二肺換気群のラットの肺組織でより顕著に見られた。Krickら[5]は.低酸素に曝されたラットの肺胞II型上皮細胞において.低酸素誘導因子（HIF-1）の誘導がアポトーシスを引き起こすことを見いだした。OLV 中.肺の非換気側が萎縮して肺胞酸素分圧が低下し.非換気試験肺組織が低酸素状態になり.肺組織細胞のアポトーシスを引き起こす可能性がある。この肺胞酸素分圧の低下は.低酸素に対する肺循環の代償反応である肺血管抵抗（HPV）の上昇を引き起こしますが.HPVはこれらの保護的役割を果たす一方で.肺組織の血液灌流量を減少させる作用も持っています。OLV群では.OLV後0.5時間.ラットが所定時間換気を再開し.換気が回復すると.肺組織への酸素供給の急速な回復により.肺組織のPMNも活性化して酸化ストレスを活性化し.血液や肺組織中の酸素フリーラジカル.腫瘍壊死因子-α（TNF-α）.インターロイキン-β（lI-β）.その他の炎症メディエイターが増加します [6]．Youらの研究結果[7]でも.ウサギのOLV中に肺組織の酸化ストレスレベルが有意に上昇し.その傾向はOLV時間が長くなるにつれて顕著になることが示されています。しかし.酸素フリーラジカル.TNF-α.LI-lβなどの大量の炎症因子は.肺胞上皮細胞や血管内皮細胞のアポトーシスを増加させ.肺血管内皮スクリーンの機能障害をもたらすことが示唆されています[8]。An S et al [9] は.小腸の虚血再灌流によりTNF-αの上昇を介してII型上皮細胞のアポトーシスが生じ.肺組織障害を引き起こすと指摘しています。非換気側の肺が萎縮した後の再開通過程では.肺胞の膨張が必ずしも整わないため.膨張した肺胞と萎縮した肺胞の接合部で生じる界面接線力によって肺胞壁が過度に伸張し.肺胞上皮細胞のアポトーシスを引き起こすことがある [10]．本実験における OLV 時間の延長に伴う肺組織内のアポトーシス細胞の増加は.肺胞構造の損傷と肺組織学的変化の悪化につながる可能性があり.これは本実験で光学顕微鏡下に観察された肺組織学的変化と一致する。
カスパーゼ-3は.カスパーゼファミリーの中で最も重要なアポトーシスエフェクターであり.アポトーシスの実行段階において主要なプロテアーゼの全てまたは一部を切断し.DNAの断片化とアポトーシス細胞死を導く役割を担っている。したがって.ラット肺組織におけるCaspase-3タンパク質の発現量の変化も.肺組織におけるアポトーシスに直接反応している可能性がある。そこで.OLV によるアポトーシス誘導のメカニズムや作用経路をさらに理解するために.Caspase-3 タンパク質の発現変化をイムノブ ロット法により検討した。実験結果より.Caspase-3 タンパク質の発現変化と TUNEL で検出されるアポトーシスの変化は概ね一致し.TUNEL アッセイの結果を確認することができた。
結論として.OLV は換気時間の延長に伴い.肺組織構造の変化をもたらし.アポトーシスとそのアポトーシス実行因子 Caspase-3 タンパク質の発現を増加させることから.アポトーシスが OLV による肺損傷の重要な要因であると推測される。しかし.より具体的な作用機序については.さらなる研究が必要である。
参考文献
[1] Zhao B, Zhang H R, Li H M et al. The relationship between mechanical ventilation-related lung injury and apoptosis in lung tissue in rats[J]. 中国実用医学雑誌,2011,38(3):50-52.
[2] Plataki M, Hubmayr RD. 人工呼吸器誘発性肺損傷の物理的基礎[J]. Expert Rev Respir Med,2010,4(3): 373-385.
[3] Li Y, Peng DH, Liang R et al. 片肺換気中の血中好中球数および換気後肺組織形態の変化[J]. 広西医科大学紀要,2009,26(5):733-734.
[4] Chopra M,Reuben JS,Sharma AC.Acute Lung Injury:Apoptosis and Signaling Mechanisms[J] .Experimental Biology and Medicine,2009, 234:361-371.
[5] Krick S, Eul BG, Hanze J,et al. Role of hypoxia-inducible factor-1alpha in hypoxia-induced apoptosis of primary alveolar epithelial type II cells.肺胞上皮細胞における低酸素誘導性のアポトーシスの役割. Am J Respir Cell Mol Biol 2005;32:395C403.
[6] den Hengst Willem A., Gielis Jan F., Lin Judy Y.,et al. Lung ischemia-Repfusion injury: a molecular and clinical view on a complex pathophysiological process[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(5):H1283-1299.
[7] You CJ, Xu HX, Zhou ZC et al. 異なる時間での片肺換気が肺の酸化ストレスのレベルに与える影響[J]. 中国総合医学,2010(12):1492-1493.
[8] Circu ML,Aw TY.Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis[J].Free Radic Med,2010,48(6):749-762。
[9] An S, Hishikawa Y, Liu J, et al. ラット小腸虚血再灌流後の肺損傷には.TNF-αとBid経路の活性化を介したII型肺胞上皮細胞のアポトーシスが関与する[J].Apoptosis,2007,12（11）:1989-2001.
[10] Hammerschmidt S,Kuhn H,Grasenack T,et al. 肺胞Ⅱ型細胞の周期的機械的伸張によって誘発されるアポトーシスとネクローシス[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004,30(3):396-402.