人工関節の周囲に存在する粒子は.マクロファージの動員や貪食を引き起こし.粒子の貪食後に活性化を起こして一連のサイトカインを放出し.炎症性肉芽腫を形成し.最終的には骨溶解やゆるみを引き起こす。 人工関節の周囲には.UHMWPE粒子.チタン粒子.骨セメント粒子など様々な粒子が存在するが.臨床組織学的観察から.異なる材質の粒子によって引き起こされる骨溶解の強さは異なり.UHMWPE粒子が最も強い影響を与えることが分かっている。 このような粒子材料の違いによる局所的な生物学的反応の違いの正確なメカニズムは不明であり.実験的研究も不足している。 マクロファージの貪食は人工関節周囲の骨溶解反応の初期段階であり.貪食が強いほど活性化し.炎症反応や骨溶解反応が強くなる。 著者らは.粒子による骨溶解の程度の違いは.粒子によって誘導されるマクロファージの貪食の程度の違いに関係していると仮説を立てている。 本実験では.粒子の材質が異なるとマクロファージの貪食も異なるという仮説を立て.UHMWPE と Ti-6AL-4V という2種類の粒子によって引き起こされるマクロファージの貪食の違いを比較し.粒子の材質によって生体反応が異なる理由を細胞レベルで検討する。 粒子と細胞 1.粒子：UHMWPE粒子は.米国John D. Dingle VA Medical CentreのWooley H.教授のご好意によりご提供いただきました。 この粒子は.平均直径2.6μm（直径範囲0.8〜23μm.）の不規則な形態を有する。 Ti-6AL-4V 粒子は.上海第二医科大学第九人民病院の整形外科研究室で作られたもので.特許番号03142073.7。 そのプロセスは.同じ材料のミルジャーに Ti-6AL-4V でできたミルブロックを入れ.70mL を加えることだった。 DMEM.シェーカーに載せて21日間振とうし.DMEM内の粒子を勾配遠心分離で抽出した。 生成されたTi-6AL-4Vペレットは.平均直径3.9μm（直径範囲0.6-31μm,)と形態が変化していた。 エンドトキシンを除去するため.ペレットを75％エタノールに懸濁し.室温で1時間ずつ4回振とう・洗浄し.100％エタノールに一晩浸漬した。 エンドトキシン含有量は0.25EU/mL以下とし.処理したペレットを懸濁し.培養液に浸漬した。 2.RAW 264.7細胞：RAW 264.7細胞（上海の中国科学院細胞研究所から購入）は.マクロファージと破骨細胞前駆細胞の二重特性を有するマウス単球／マクロファージ系に属し.10％牛胎児血清および1％ペニシリン／ストレプトマイシン含有DMEMで37℃.5％CO2で培養される。 実験はペレットにより2群に分け.UHMWPEペレットとTi-6AL-4Vペレットを培養液に添加し.RAW264.7細胞をペレット刺激条件下で培養できるよう0.1mg/mLに濃度を調整した。 RAW 264.7細胞による2種類の粒子の貪食の比較観察 1.最適細胞応答密度の決定：本実験では.粒子に対する最適細胞応答密度を求めるためにMTT法を用いた。 マクロファージ（RAW264.7細胞）をUHMWPE粒子およびTi-6AL-4V粒子とそれぞれ1×103/mL.1×104/mL.1×105/mL.1×106/mLの密度で共培養し.72h後にMTT細胞生存率アッセイを実施した。 その結果.1×105/mLの密度のRAW264.7細胞が.0.1mg/mLの濃度の粒子による刺激に最も敏感であることがわかった。 2.粒子貪食の観察：1×105/mLの密度のRAW264.7細胞を0.1mg/mLのUHMWPE粒子およびTi-6AL-4V粒子とそれぞれ共培養し.培養後1.4.12.48および72時間目に細胞を光学顕微鏡で観察し.粒子の貪食の様子を観察した。 また.各視野で貪食された顆粒を含む細胞の全細胞数に対する割合を1.4.48.72h目に100倍の光学顕微鏡視野でカウントし.3回繰り返しながら統計解析を実施した。 統計処理 統計ソフトSPSS10.0を用いてカイ二乗検定を行い.統計的有意性はр＜0.05とした。 結果 マクロファージによるUHMWPE粒子の貪食 UHMWPE粒子で刺激されたマクロファージの貪食反応は.迅速かつ強力であった。 48時間後.96.4%の細胞が貪食された粒子を含んでいた。72時間後.細胞は粒子で飽和し.貪食された粒子を含む細胞の比率は増加しない。 同時に.貪食後の細胞は増殖せず.細胞体の肥大化.目玉焼き状.細胞の脱落などのアポトーシス現象を示すことが確認された。 培地を通常の培地に変えると.貪食された粒子を含む細胞は死滅・脱落を続け.粒子を貪食しなかった残りの細胞はディッシュ全体が覆われるまで増殖し始めた。 Ti-6AL-4V粒子のマクロファージ貪食 UHMWPE粒子と比較して.Ti-6AL-4V粒子はマクロファージの貪食を引き起こすのが遅く.粒子を貪食する細胞の割合も比較的少なかったが.この現象は培養初期により顕著に見られた。 RAW 264.7細胞とTi-6AL-4V粒子の共培養後1時間では.粒子に対する細胞の貪食はほとんど見られなかった。 培養後4hでは.ペレットの細胞貪食が少量見られた。 培養時間が長くなるにつれて.ペレットを貪食する細胞数は徐々に増加したが.その割合は同じ時間帯のUHMWPEペレット群と比較して著しく少なかった。 72hまでに.70%以上の細胞が貪食顆粒を含んでいた。 顆粒を貪食した細胞の形態変化は少なく.アポトーシスの脱落の兆候はほとんど見られなかった。 考察 UHMWPEは骨溶解を引き起こす主な粒子である 人工関節の周囲には.UHMWPE粒子.チタン粒子.骨セメント粒子.純チタン粒子.コバルト-クロム-モリブデン粒子など様々な摩耗粒子が存在し.人工関節の周囲に生体反応を起こし.一連の病的変化を経て最終的に骨溶解やゆるみを引き起こすことがある。 臨床組織学的観察によると.人工関節の周囲で最も一般的で数の多い粒子はUHMWPE粒子であり.これは他の粒子よりも人工関節周囲の生物学に密接に関係しており.骨溶解とゆるみを引き起こす最も重要な粒子である。境界膜内のUHMWPE粒子が1×1010/gを超える場合.ほぼ確実に骨溶解とゆるみが起こり.人工関節の寿命が著しく短くなる。 UHMWPE粒子が他の粒子よりも骨溶解を引き起こしやすい理由は.まだ十分に解明されていない。 粒子が骨溶解とゆるみを引き起こす主なメカニズムは.人工関節を取り囲む細胞の生物学的反応を刺激し.局所的な生化学的環境の変化と骨代謝のアンバランスをもたらすことである。 マクロファージは体内の主要な防御反応細胞であり.顆粒と最も直接的かつ密接な関係にある。 組織学的観察によると.よく固定された人工関節の人工関節周囲膜には少数の顆粒とマクロファージしか存在しなかったが.緩んだ人工関節の部分的に厚くなった膜には多数の顆粒が存在し.顆粒を貪食するために多数のマクロファージが動員され.マクロファージの数は顆粒の数と量に比例したことから.顆粒がマクロファージを人工関節の周りに動員して彼らに貪食させることができると考えられた。 また.この実験の結果.マクロファージはUHMWPE粒子を接触させてからわずか1時間後に貪食し始め.その貪食量は時間とともに著しく増加したことから.マクロファージには粒子を貪食する能力があることが確認された。 貪食後.マクロファージは活性化され.一連の反応を起こし.周囲の生化学的環境の変化と自身の形質の変化を引き起こします。 まず.マクロファージは貪食後.TNF-α.IL-1.IL-6.MMPなど様々な生化学的メディエーターやサイトカインを分泌し.人工関節周囲の炎症性肉芽腫や骨吸収を引き起こす。 次に.マクロファージは破骨細胞の前駆細胞であり.肉芽刺激下では分化した破骨細胞が増加し.骨吸収能力が高まるため.局所の骨代謝のバランスが崩れ.人工関節周囲の骨溶解を引き起こす。 マクロファージにおける上記のような生物学的変化は.粒子との接触.あるいは粒子の嚥下によってのみ起こるはずであり.粒子と細胞の接触が妨げられれば.上記のような変化は起こらないことが実験によって示されている。 UHMWPE粒子とチタン粒子の貪食性の比較 この実験により.Ti-6AL-4V粒子と比較して.UHMWPE粒子はマクロファージの迅速かつ強い貪食性を誘導できることがわかった。uHMWPE粒子はマクロファージとの接触直後に貪食され.時間と共に貪食が明らかになり.粒子含有細胞の割合が急速に増え.72時間までに.その割合は 貪食は72hまでに飽和した。 一方.Ti-6AL-4V群では.貪食の発生が遅く.同時期に貪食された顆粒を含む細胞の割合がUHMWPE群に比べ有意に少なかった。 これまでの研究で.UHMWPE粒子が骨溶解の発生に大きく関与する主な理由は.他の粒子の総数をはるかに上回る数の粒子が存在するため.より強い生体反応を引き起こすことにあると考えられています。 この実験の結果.同じ粒子密度であっても.UHMWPE粒子はチタン粒子よりも強く.迅速にマクロファージによる貪食を刺激することがわかりました。 マクロファージが生物学的に反応する前に粒子を貪食する必要があるので.UHMWPE粒子自体も他の粒子よりも強い貪食とマクロファージの生物学的反応を誘発し.より多くの炎症メディエーターとサイトカインを産生すると推測され.別の観点からUHMWPE粒子が他の粒子よりも骨溶解を誘発しやすい理由を説明しています。 結論として.UHMWPE粒子はTi-6AL-4V粒子よりもマクロファージの貪食が早く.強く誘導され.それが一連の生化学反応につながり.最終的に骨溶解反応やゆるみが強くなる。