前文：遺伝性疾患の出生前診断では.通常.あらかじめ決められた症例（遺伝性疾患を持つ人）である家族の遺伝子検査が必要です。 変異座が発見された後.家族に次の子供が生まれるリスクのある妊婦は.胎児が同様の疾患に再感染しているかどうかを調べるために.一定の妊娠期間に絨毛膜絨毛検査または羊水穿刺を受けなければなりません。 しかし.病状が重く.出生後すぐに死亡（死去）したため.決定的な遺伝子検査ができず.ご家族に出生前診断を提供できないケースもあるようです。
北京大学第一病院皮膚科の遺伝病ユニットは.遺伝性皮膚疾患の出生前診断に長い歴史を持ち.遺伝子検査と出生前診断の豊富な経験を蓄積しています。 また.発症前の両親の遺伝子検査結果がない場合.保因者の両親の遺伝子検査を直接行うことで.発症前の両親の遺伝子異常を推測し.家族が再び妊娠するための正確な出生前診断を行うことに成功しました。 北京大学第一病院皮膚科の林志妙をはじめとする遺伝性皮膚科学研究チームによる成功事例から.以下の論文で.その検査過程を詳しく紹介しています。
コロジオンベビー（CB）とは.生まれたばかりの赤ちゃんが.全身を覆う張りのあるゼラチン状の膜を持ち.全身の皮膚の紅潮を伴うことがあります。 体中の皮膚が緊張して引っ張られる結果.赤ちゃんはまぶたの外反.唇の外反.まばらな髪.耳の軟骨変形.手足の指の屈曲などの変形を起こすことがあります[1]。 CBは.様々な遺伝的皮膚疾患によって引き起こされる可能性があり.最も一般的なのは常染色体劣性遺伝性先天性魚鱗癬（ARCI）です[2]。 出生前診断では.患者または家族保因者の原因遺伝子変異座を特定し.妊娠中に絨毛膜絨毛穿刺または羊水穿刺により胎児組織標本を採取して対応する変異座を解析し.胎児が家族性遺伝性疾患を有しているかどうかを判定します[3]。 候補遺伝子除外法により.ケロシンゴム様の赤ちゃんを出産された2組のご夫婦の出生前診断に成功しました。
対象および方法
I. 対象物
家族1.CBを2回分娩したため当院遺伝性皮膚科を受診した健康な夫婦。 両CBとも出生後半透明のゼラチン状物質に覆われ.眼瞼外反.全身の紅潮を認め.3週間頃より物質が落ち始め.一部小胞やにじみも認め.敗血症性皮膚感染と発熱を伴っていた。 家族2は.半年前にCBを出産した健康な夫婦が来院されました。 また.出生後.全身の紅潮と緊張性の膜状腫瘤.眼瞼外反.まばらな毛髪を呈していた。 生後数日の乳児が.哺乳障害.二次感染.水電解質異常のため1週間以内に死亡した。 両家ともCBの病歴は両親の自己申告によるものであり（どちらも子供の写真を提供できなかった）.CBは出生病院の皮膚科医によって診断された。 両夫婦とも皮膚は全く正常で.魚鱗癬様病変は見られず.血族結婚を否定し.その他は家系的に類似した患者がいた。 胎児は2人とも生後間もなく死亡したため.胎児組織標本を得ることはできなかった。
II. 方法
1.DNA抽出：両家の患児の両親からそれぞれ5mlの末梢血を採取し.2％EDTAで抗凝固した後.低張溶血とフェノール-クロロホルム抽出によりゲノムDNAを抽出した。
2.TGM1.NIPAL4.ALOX12B遺伝子のPCR増幅とDNAシークエンス：遺伝子配列に従って特異的プライマーを設計し.上記遺伝子のコーディング領域とその近傍配列を増幅するのに使用した。 発熱性乳幼児における原因遺伝子の出現率に基づき.両親ともに同じ原因遺伝子の変異座を持つことが判明するまで.感染児の両親それぞれについて原因遺伝子の疑いがある遺伝子を検査した。 変異遺伝子座の病原性はMutationtasteオンラインソフトウェア（http://www.mutationtaster.org/）を用いて予測し.同定された変異遺伝子座を200の無関係な正常DNAの中で順位付けした。
3.出生前診断：家族1では.罹患した母親が妊娠11週目に絨毛穿刺サンプリングを受け.胎児絨毛組織DNAを抽出した後にPCRを行ってTGM1遺伝子病原遺伝子座のエクソンの増幅と塩基配列を決定した。 ファミリー2では.母親が妊娠18週に羊水穿刺を受け.羊水細胞の一部を直接DNA抽出.ALOX12B病原性遺伝子座エクソンの増幅.シークエンスに用い.羊水細胞の一部を培養に用い.羊水細胞が壁化した後.液交換を行い浮遊母血の汚染を取り除き.培養羊水細胞を再度ALOX12B病原性遺伝子座エクソンのDNA増幅とシークエンスに使用しました。 培養羊水細胞のDNAを増幅し.再度シークエンスを行い.ALOX12B遺伝子の病原性遺伝子座を免除した。
結果
I. 病原遺伝子の変異遺伝子座
我々は.家族1の父親のゲノムDNAから.TGM1遺伝子にc.C427Tのヘテロ接合性変異を検出した。この変異は.コードされたトランスグルタミナーゼ蛋白質1にp.Arg143Cysのアミノ酸置換をもたらし.ラメラ魚鱗癬患者で以前に報告された高度保存突然変異部位であった。 delGヘテロ接合型変異により.コーディングタンパク質p.G369fsX13にシフト変異が生じ.変異したアミノ酸の下流のアミノ酸13に早期停止コドンが生じ.切断型タンパク質の出現に至る。 家族2の子供の両親のTGM1およびNIPAL4遺伝子には.病原性のある突然変異は見つからなかった。 父親はALOX12B遺伝子にc.1463G>Aヘテロ接合型変異を有し.コードされたタンパク質にp.Arg488Hisアミノ酸置換が生じ.母親はALOX12B遺伝子にc.1642C>Tヘテロ接合型変異を有し.コードされたタンパク質にp.Arg548Trpアミノ酸置換が生じており.いずれもケロシン様乳児で報告があるものです いずれの変異部位もG. pyrifera様幼児で報告されており.高度に保存されたアミノ酸遺伝子座である。 4つの変異遺伝子座はすべてMutationtasteによって病気の原因となることが予測され.200人の正常な個体には見られなかった。
II.出生前診断
妊娠11週目に絨毛膜絨毛穿刺を行い.PCR増幅とDNA塩基配列を決定した結果.胎児は健康であることが判明しました。 家族2では.妊娠18週目に採取した母親の羊水穿刺サンプルのPCR増幅とDNA配列決定により.胎児がALOX12B遺伝子を父方の変異遺伝子座c.1463G>Aで.母方の変異遺伝子座c.1642C>Tを持たず.羊水細胞培養後の繰り返し検査で一致し.胎児は健常キャリアと決定されました。 経過観察では.2人の胎児は健康な新生児として生まれました。
ディスカッション
CBは様々な遺伝性皮膚疾患に見られるが.ARCIは最も一般的な疾患である[1]。 CBは.様々な症候性・非症候性魚鱗癬.Gaucher病などの代謝性疾患.外胚葉形成不全などの疾患でも見られることがあります[4, 5]。 ラメラ魚鱗癬の重篤な臨床表現型[2]。 しかし.生後間もない時期には.皮膚のバリア機能が著しく低下しているために経皮水分損失が著しく増加し.体温調節のアンバランス.水電解質異常.皮膚損傷による感染の可能性が高くなり.CBはこの時期に十分にケアされないと非常に致死的となります[1]。 本研究の2家族の3人のCB児はすべて生後まもなく死亡したが.これはCBの初期段階における高い死亡率と地元の病院におけるケア経験の不足に関連していると思われる。 その時は.子供の早期死亡.病理学的・組織化学的検査のための皮膚組織標本が得られなかったこと.さらにこの病気の臨床症状を理解できなかったことなどから.どちらの家族もこの病気の最終診断を得ることはできなかった。
遺伝性疾患の出生前診断では.通常.出生前または患者において原因遺伝子の変異座を特定し.その後.再発の危険性のある胎児の羊水細胞または絨毛絨毛組織標本を検査して胎児の遺伝子型を決定し.それによって胎児が影響を受けているかどうかを判定する必要がある[3, 7]。 この研究では.どちらの家系でも患者のDNAが入手できなかったため.確立した保因者の親のDNAのみを用いて病原性突然変異座を検索することができた。 CBはARCIと最もよく関連しているため.まず.両家の子供の両親を対象に.ARCIを引き起こす6つの原因遺伝子をスクリーニングすることを提案しました。 6つの病因遺伝子から選択する特徴的な臨床表現型がないため.文献検索によりARCIを引き起こすと報告された6つの遺伝子の割合（TGM1>NIPAL4>ALOX12B>CYB4F22>ABCA12>ALOXE3）に従って.病因遺伝子を特定するまでそれぞれ降順にスクリーニングを行った[8]。 患児の両親ともに同じ遺伝子に病原性変異座が認められた場合にのみ.その遺伝子を家系内のパイロジェニックガム様幼児を引き起こす原因遺伝子とみなしたのです。 両家で同定された3つの変異遺伝子座（TGM1のc.C427T.ALOX12Bのc.G1463Aおよびc.C1642T）は.ARCI症例で以前に報告されていた。 未報告の変異部位（TGM1のc.1106delG）は.タンパク質の切断を引き起こすシフト変異であり.コードされたタンパク質の構造を著しく短縮または変化させ.同じ人種の正常者200人に見られないことから.病原性変異部位である可能性が高いと考えられます。 夫婦ともに原因遺伝子のキャリアであるため.CBで2回目の妊娠をする確率は25％であり.妊娠中の出生前診断を推奨しています。
出生前診断は.妊娠9-11週の絨毛膜絨毛吸引.または妊娠16-20週の羊水穿刺による染色体またはDNA分析により行われます。 絨毛膜絨毛吸引法は.胎児疾患の早期発見が可能であるため.母体への不必要な苦痛を軽減できるという利点がありますが.羊水穿刺よりもやや難易度とリスクが高く.絨毛膜絨毛細胞の培養が難しいため.母体の血液や母体組織の混入が疑われる場合は.後日検証することが困難となります。 一方.羊水細胞培養は比較的簡単に行えるため.後日.母体の血液汚染を除外することが容易である。 2つの家族は.状況に応じて胎児検体の採取方法を選びました。 出生前診断の結果は.2例とも正確でした。
本研究は最終的に両家の出生前診断に成功したが.第一世代のシークエンス（サンガーシークエンス）法に基づく検出は.病因候補遺伝子の数が多いことから.時間と労力とコストがかかると思われる。 近年.超並列DNAシーケンサによる第2世代シーケンサのコストが低下しており[9, 10].1つの反応系やマイクロアレイに多数の候補遺伝子を集中させて捕捉し.ハイスループットなシーケンサを行えば.人的・物的コストの大幅削減と検出スピードの向上が期待されます。 将来的には.臨床検査や実験室での検査において.第一世代シーケンサーに取って代わる可能性があります。 当研究室では.華康遺伝学研究所と共同で.遺伝性魚鱗癬の報告されているすべての病因遺伝子のコード配列を含む第二世代シーケンサー用キャプチャシステムを開発し.現在.感度および特異性の検証を行っています。
図1 患者の両親の塩基配列。1aは家族1の両親のTGM1遺伝子のc.C427Tとc.1106delGのヘテロ接合性変異.1bは家族2の両親のALOX12B遺伝子のc.G1463Aとc.C1642Tのヘテロ接合性変異をそれぞれ示している。