WU Hanqing WANG Bo ZHU Shikai ZHANG Jianjun WANG Chunyou WU Heshui* 【要旨】 目的 ヒト膵臓癌および膵臓癌細胞におけるTLR9の発現を検出し.CPG ODN2216のPanc-1細胞の生物学的挙動に対する影響を調べ.その臨床的意義を探求すること。 方法 膵臓癌組織における TLR9 タンパク質の高発現を免疫組織化学で確認し.膵臓癌細胞株 Panc-1 における高発現を免疫蛍光法で確認した。 CPG ODN2216の細胞接着性.運動性.増殖性への影響を.細胞接着.スクラッチアッセイ.浸潤アッセイ.細胞クローニング.MTT値付加アッセイにより検討した。 その結果.ヒト膵臓がん検体およびヒト膵臓がん細胞株Panc-1ともにTLR9が高発現しており.CPG ODN2216の細胞接着性および運動性は.スクラッチアッセイ.in vitro接着アッセイ.ストロマゲル侵入アッセイおよび細胞クローニングアッセイにおいて非配列対照群と比較して著しく低いことが示されました。 付加価値活性は時間用量依存的であった。 結論 TLR9 遺伝子は.ヒト膵臓癌の浸潤転移能と関連しており.外因性リガンド CPG ODN2216 の使用により.ヒト膵臓癌細胞 Panc-1 の浸潤・遊走能を有意に抑制することが可能である。 武汉协和医院急诊科吴汉青【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学 Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancerHan-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui WuDepartment of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vit しかし.TLR9はこのファミリーの重要なメンバーであり.B細胞や樹状細胞によるインターロイキン（IL）-12.IL-6.インターフェロン-γ.単球抑制タンパク質.金属タンパク質分解酵素などの多数のサイトカインおよびケモカインの発現を刺激する[2]。 膵臓がんにおける TLR9 遺伝子の役割を調べるため.膵臓がんでの高発現を確認した後.TLR9 の特異的リガンドである合成オリゴデキシヌクレオチド 2216（CPG ODN2216）を用いて.膵臓がん細胞 Panc-1 を刺激し.その成長・増殖.腫瘍形成能.膵臓がん発がん能を観察しました。 この結果は.TLR9遺伝子が膵臓癌細胞の発生と増殖に関与していることを示し.TLR9遺伝子の特異的メカニズムのさらなる研究のための情報を提供する。 1. 材料と方法 I. 実験材料 1. 細胞：ヒト膵臓癌細胞Panc-1は.華中科技大学同済医科学院ユニオン病院一般外科研究所から提供された。 2.組織切片：膵臓癌患者からヒト新鮮膵臓癌組織および対応する傍癌組織（腫瘍縁に準じて1〜2cm）を30例.他の理由で膵臓部分切除を必要とする非腫瘍患者から正常膵臓組織標本を10例入手した。 2.検体はすべて華中科技大学連合医科大学膵臓外科センターで外科治療を受けた膵臓癌患者のもので.術後の病理検査で確認した。 3.一次試薬： CpG-ODN2216 （配列 GGGACGATCGTCGGGG）.合成は上海生物工学廠生物工学サービス有限公司が担当した。 モノクローナル抗体（Cell Signaling Company）。 免疫組織化学および蛍光キット（Wuhan PhD Company）。トランスウェル（Coring Company）。マトリゲルゲル（Sigma Company）；DMSOによるMTT（sigma Company）。 II.実験方法 1.免疫蛍光化学：膵臓癌由来のPanc-1細胞をトリプシンで消化して単一細胞懸濁液とし.これをスライドに滴下した。 クローリングスライドは.細胞の増殖状況に応じて24時間以上.適時除去した。PBSで3回ずつ5分間すすぎ.4％パラホルムアルデヒドで15分間固定.PBSで3回すすぎ.0.5％Tritonで20分間穿孔.PBSで3回すすぎ.5％BSAで30分間閉塞.液を振り切ったら希釈一次抗体を直接添加.コントロール群はPBSに入れ替えた 一次抗体 4℃で一晩インキュベートし.PBSで3回リンスし.希釈した二次抗体を加え.37℃で1時間インキュベートする。PBSで3回リンスし.希釈したSABC-FITCを加え.37℃で30分インキュベートする。PBSで3回リンスし.水溶性シーラーで封をして蛍光顕微鏡による観察 2. 免疫組織化学：パラフィンを脱脂してアルコールで水分を補給。3％の過酸化水素を10分間室温で漬け込み.その後に.3％の酸化防止剤を加えた。切片は0.01moLクエン酸緩衝液（pH6.0）で抗原性修復を行った。 切片は5％ヤギ血清BSAで30分間室温でブロッキングし.ブロッキング液を廃棄した。 適切に希釈した一次抗体を添加.一次抗体の代わりにPBSでコントロール.4℃で一晩。PBSで5分ずつ3回洗浄.ビオチン標識二次抗体を添加.室温で30分インキュベート.PBSで3回洗浄.SABC添加.室温で30分インキュベート。PBSで洗浄後DAB染色.ヘマトキシリン再染色.脱水.透明化.ブロック.結果を顕微鏡観察 3. ジフェニルテトラゾリウムブロマイド Blue（MTT）法による膵臓がん細胞の増殖検出：消化膵臓がん細胞懸濁液を96ウェル培養プレートに1×103/ウェルで100μlずつ接種し.37℃.5％CO2.飽和湿度の条件で培養し.24時間後に異なる濃度（0.1μg/ml, 0.5μg/ml, 1μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml）で培養を行いました。 )のCPG ODN2216作用細胞Panc-1を.それぞれ24時間.48時間.72時間培養後.5mg/ml濃度のMTTを20μl加え.4時間培養後.上清を捨て.ジメチルスルホキシドを150μl/ウェル加え.振って混ぜ.酵素標準物質を用いて波長490nmでA値を決定した。 阻害率＝（A対照-A薬剤群）／A対照×100％[3]。 増殖阻害曲線をプロットし.半数阻害濃度（IC50）を測定した。 4.スクラッチングアッセイ：細胞濃度2×105/mlのPanc-1細胞懸濁液を6wellプレートに3mlずつ加え.24h以上培養した。 細胞の増殖が80%フルになった後.培養液を捨て.CPG ODN2216をそれぞれ1μg/ml.10μg/mlの濃度で添加し24h培養を継続した。 上清を捨て.セルスクレーパーでウェル中央の細胞に傷をつけ.傷の端に沿って等間隔に4つ印をつけ.データ点とし.平均値をとった。 5.細胞接着アッセイ：96ウェルプレートをプレーティングし.風乾し.BSAでブロックし.60分間インキュベートした。コントロールと実験群（CPG ODN 1μg/mlと10μg/mlで24時間）の細胞濃度を（5×105）/mlに調整し.200μL/ウェルで接種.1時間培養.PBSで洗浄.5mg/ml MTT添加.4時間培養をした。 細胞接着阻害率（％）＝（A対照群-A薬剤群）／A対照群×100％。 6.細胞浸潤アッセイ：Transwellメンブレンの上室側に人工基底膜ゲルを30μL添加し.風乾した。200μL（1×105細胞含有）の細胞をそれぞれ24時間飢餓培養に加え.CPG ODNの濃度を1μg/mlと10μg/mlに調整した。10μLを含有する浸潤細胞の下室500μLは.10μg/mlに調整し た。 24時間後.チャンバーを取り出し.未移植の細胞と上部のチャンバー内の余分な液体を綿棒で拭き取りました。 チャンバーを4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し.1%クリスタルバイオレットで30分間染色した。 メンブレンを脱イオン水でよく洗浄した。 その細胞を顕微鏡で観察し.数を数えた。 各細胞群に3つの二次ウェルを設定し.平均値をとった。7.細胞クローニング実験：Panc-1細胞をトリプシンで消化し.ブローして単一細胞懸濁液とし.6ウェルプレートに約200細胞/ウェルを接種.CPGなし群とCPGの濃度をそれぞれ1μg/mlと10μg/mlに設定して.各細胞群に2つの二次ウェルを設定した。 接種した細胞はインキュベーターで14日まで培養し.肉眼で細胞クローンが見えた時点で培養を終了し.培養液を除去.PBSで洗浄.ヘマトキシリンで30分染色.PBSで洗浄.細胞クローンの形成率を数え.デジタル写真撮影を行った。 8.統計分析：実験データはSPSS13.0ソフトウェアで分析し.すべてのデータは平均±標準偏差で表した。