着床前遺伝子診断（PGD）とは.胚移植前に配偶子または胚の遺伝物質を分析し.遺伝子異常のない胚を移植用に選択することである。 着床前遺伝子スクリーニング（PGS）は.染色体に異常のない胚を移植用に選択することで.体外受精-胚移植の成功率を高めるものです。 1990年に世界初のPGDベビーが誕生し.2004年には1000人以上の正常なPGD診断ベビーが誕生し.2010年には世界で約1万人のPGD・PGSベビーが誕生すると言われています。
1.PGDとPGSの適応症
(1) PGDの適応症
単原性・性連鎖性遺伝子疾患：世界初のPGD診断はX連鎖性劣性遺伝子疾患であり.Handysideらは胚の性別を調べることで移植用の女性胚を選択でき.妊娠に成功した。 1999年には.中国本土で初めて孫中山大学第一病院で実施された。 単発性遺伝子疾患のPGDでは.遺伝的に病気の原因となる遺伝子を検出し.遺伝子変異のない胚を選んで移植し.子孫の病気を回避するが.性連鎖性遺伝子疾患では.さらに.遺伝子変異のない胚を選択する。 性連鎖性遺伝性疾患の場合.胚の性別を特定することで.子孫の罹患を回避できる可能性もあります。 しかし.X連鎖劣性疾患の場合.雄の胚を選んで移植すると.子孫は発病しないものの.理論的には雄の正常胚の50％が廃棄され.雌のキャリア胚の50％が保持されることになる。
(染色体異常：染色体異常は.数値異常と構造異常に分けられ.例えば.47,XXX（クローン病）やターナー症候群（45,XO）は数値異常.相互転座.ロバートソン転座.逆位は構造異常となります。 相互転座は.2本の染色体が切断され.トロフェクトドメインの切断がない状態で交換された後.再び結合することで起こります。 平衡転座とも呼ばれ.通常.知能や表現型は正常ですが.不均衡な配偶子が作られるため.生殖能力の低下.流産の再発.出産時の奇形児の発生などの原因となる場合があります。 PGDにより.正常またはバランスのとれた胚を移植用に選択することで.このグループの不妊問題を解決することができます。
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）技術は.染色体異常のPGDの分野で10年以上使用されています。 染色体異常の種類によってプローブの選択や実験プロトコルの設計が必要なため.診断対象となる染色体条数は非常に限られるが.FISHは簡単に実施できるため.多くの染色体異常のカップルの不妊問題を解決してきた。 近年.分子生物学技術の発展に伴い.染色体異常のPGDに遺伝子チップや第2世代シーケンサーを採用するケースが増えています。 これらの新しい技術は.問題のある染色体だけでなく.他のすべての染色体も検出できるため.より多くの遺伝情報を提供することができます。
(3）ヒト白血球抗原（HLA）マッチング：血液疾患の子どもを持つ家族の中には.PGDにより.患児と同じHLA選択型の胚を移植し.既存の血液疾患の子どもを救うことができる場合があります。 しかし.PGDの赤ちゃんは「命を救う赤ちゃん」だから生まれるのであって.他の胚は「命を救う機能」がないから廃棄されるわけで.倫理的に問題があるのです。
(4）ミトコンドリア病：ミトコンドリア病や酸化的リン酸化病の約15％は.ミトコンドリアDNA（mtDNA）の母方遺伝性変異が原因である。 したがって.PGDによりmtDNA変異率が発病の閾値以下の胚を選択することで.子孫の発病リスクを低減することができる。
PGSの適応：PGSは.妊娠率および生児率の向上を目的とした胚スクリーニングの方法です。 PGSは1993年にMunnéらによって初めて報告され.その後年々利用が進み.欧州ヒト生殖・発生学会（ESHRE）PGD Collaborationでは2009年に3551サイクルのPGSが報告されています。
PGSの主な適応症は.原因不明の不妊症の再発.原因不明の流産の再発.女性の高年齢化などです。 PGSの使用についてはまだ議論の余地がありますが.大多数の学者はPGSのためのFISHの放棄を提唱しており.多くの研究がPGSが受精率を高め.自然流産率を下げ.異数性妊娠を減らし.生殖補助医療技術の成功率を改善できることを示しています。しかし.大規模サンプルを用いた多施設共同研究でさらなる確認が必要とされています。
2.着床前診断とスクリーニングサンプリング
採取は.得られた細胞が遺伝子診断に適していることを確認するだけでなく.採取が胚の発生に与える影響を最小限に抑えるためにも.PGDおよびPGSにおいて重要なステップとなります。
PGDの材料となるもの
(1) 極体：極体は卵母細胞の副産物であり.胚の発生に与える影響は少ない。 極体では.比較的長い時間遺伝子診断を行うことができ.新鮮なサイクルでの胚移植が容易になります。 しかし.極体を使っても.母親からの遺伝情報しか推測できません。
(2) シゾント：卵原体胚のシゾントを用いた単細胞遺伝学的解析は.両親からの遺伝情報を同時に解析することができ.これまでのPGD作業ではサンプリングが主流であった。 しかし.診断用の細胞が限られていることや.キメラ卵原体胚の割合が高いことから.現在では分割採卵の割合は減少しています。
(3）胚盤胞回収：胚盤胞期キメラの割合は卵生期に比べて著しく低く.胚盤胞対宿主細胞回収は得られる細胞数が多く遺伝子診断の精度を高めるだけでなく.胚へのダメージも比較的少ない。 もちろん.胚盤胞培養技術の高度化.ガラス化・凍結融解技術.レーザー機器の開発なども.胚盤胞サンプリングが広く行われるための技術となっています。
PGD検索方法
胚の回収はPGDのプロセスにおいて重要なステップであり.その成功はPGDの最終診断に直接影響を与えるだけでなく.胚にとっても侵襲的な処置である。 回収のプロセスは.透明帯のパンチングと細胞採取の2つのプロセスからなる。 透明帯の打ち抜き加工には.化学的方法.機械的方法.レーザーによる方法があります。 化学的方法は.チロデ酸による胚へのダメージの可能性があるため.ほとんど使われていません。機械的方法は.胚へのダメージは比較的少ないものの.技術的に難しく.体外で行うには時間がかかるため.徐々にレーザー法に取って代わられつつあります。
レーザーによる透明帯穿孔法とは.レーザー発生装置で発生させたレーザーエネルギーにより.局所の透明帯を溶かし揮発させ.レーザーエネルギー.作用時間.パルス数を調整することにより.透明帯の穿孔の大きさを制御することができる。
3.遺伝子診断技術
(1) PCR技術のPGDへの応用：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は.一対のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとして.プライマー認識部位を挟む2本の相補鎖上にDNAポリメラーゼを誘導し.鋳型変性.アニーリング.伸長の3ステップを1サイクルとして.各サイクルの生成物を次のサイクルの鋳型として使用できるようにしたもの。 各サイクルの成果物は.次のサイクルのテンプレートとして使用することができます。 世界で初めてPCRによるPGDが行われた事例。
PGDやPGSの診断材料は.DNA量が少ない1個または数個の細胞であるため.増幅不良や増幅バイアスが起こりやすく.PGDやPGSの発展に大きな制約を与えているのである。 多くの研究者がnested PCR.multiplex PCR.fluorescent quantitative PCRといったPCR由来の技術を開発し.PGD診断の幅をある程度広げたが.まだ非常に限定的なものである。
近年.ゲノム配列全体を非選択的に増幅し.配列の偏りなくDNAの総量を大幅に増やすことを目的とした全ゲノム増幅法（WGA）が急速に発展し.PGDやPGSの分野をリードしています。 PGDとPGSで使用されるより一般的なWGA技術には.De Minimis Oligonucleotide Primer PCR（DOP-PCR）.前増幅プライマー伸長反応PCR（PEP-PCR）.多重鎖置換増幅（MDA）と多重アニーリングループ増幅（MALBAC）が含まれます。
遺伝子チップ検出や第二世代シーケンサーにWGA製品を使用する方法は.現在PGDやPGSの分野で最も広く使われている方法であり.後で詳しく説明することにしています。 Single-cell PCR技術は実験室に負担をかけるだけでなく.増幅の失敗.コンタミネーション.対立遺伝子のデキャップなどの問題がある。
(2) PGD・PGSにおけるFISH技術の応用：FISHとは.蛍光色素で標識した特定のDNAプローブを.組織細胞中の測定したい特定の染色体配列に一定の条件下でin situハイブリダイゼーションさせ.そのハイブリダイゼーション信号を蛍光顕微鏡で表示・観察する診断技術。fISHは主にPGDにおいて性連鎖疾患や染色体異常の診断に用いられている。 FISHはDNA増幅を必要とせず.比較的簡便に実施できるが.FISHで検出できる染色体数が10〜12本と限られており.検出する染色体によって異なるプローブを選択する必要があり.シグナル判定が困難な場合がある。 近年.FISH技術は遺伝子チップ技術や次世代シーケンサー（NGS）技術に取って代わられつつあります。
(3) 遺伝子マイクロアレイ技術のPGD・PGSへの応用：遺伝子マイクロアレイ技術は.数千の既知の遺伝子の多型や変異を同時に検出することができる。 現在.遺伝子マイクロアレイの臨床応用としては.比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）.一塩基多型（SNP）などが主なものである。 CGHやSNPの技術は.3Mbp以上の繰り返しや欠失など.より微細な染色体変化を検出することができます。
を検出することができます。 シングルセル全ゲノム増幅とマイクロアレイ技術の組み合わせにより.単細胞あるいは微小な細胞の染色体状態を検出することができます。 そのため.染色体異常のPGSやPGDの分野では.CGHやSNPマイクロアレイが広く利用されています。
(4) PGDおよびPGSにおけるNGS技術の応用：NGSは従来のサンガーシーケンスと相対するもので.スケールアップしたシーケンスのプロセスを変え.単一のテンプレートを区別するのではなく.テンプレートはシーケンスが必要なすべてのテンプレートを含む「ライブラリ」になるという特徴があり.やはりテンプレートに基づいて行われます。 塩基配列は合成またはハイブリダイゼーションにより相補鎖を形成し.相補鎖の伸長時に導入される蛍光マーカーにより各塩基が識別される。 2008年以降.全ゲノムシーケンスのコストは飛躍的に低下し.これがNGSがPGDやPGSの臨床利用に踏み切る重要な条件となった。
NGSに関しては.シーケンシングデプスという重要な用語にも言及する必要があります。 配列決定深度とは.ゲノムサイズに対する配列決定された総塩基数（bp）の割合のことで.一般的にはゲノムの配列決定回数と理解されている。 シーケンスの深さとゲノムカバレッジには正の相関があり.シーケンスの深さが増すにつれて.シーケンスによるエラー率や偽陽性結果は減少します。
また.PGDやPGSのNGSには2種類あり.一つは採取した細胞をまずWGAにかけ.その後NGSを行うもので.こちらの方がより一般的な方法です。 もう一つは.サンプリングした胚細胞をWGAにかけず.擬似PCR技術で特定の断片を大量に増幅し.この増幅断片をNGSにかける方法である。
2013年のESHRE年次総会では.WellsらがNGS-PGSによる妊娠の成功を報告し.同年.UW-GeneとXiangya病院もNGSで検出した胚盤胞によるPGSの成功例を報告した。 2013年.Treffらは6組のカップル（嚢胞性線維症2組.Walker-Warburg症候群.家族性植物機能不全.X連鎖性低リン酸血症くる病.神経線維腫各1組）に対してPGDを実施しました。 遺伝子診断技術は.他の研究室ではqPCRとNGSの技術がそれぞれPGDの診断に使われていた。 2014年.北京大学病院生殖医療センターで世界初.2例目のMALBAC増幅シークエンスPGD児が誕生し.それぞれ遺伝性多発性骨軟骨腫とX連鎖性低汗症外胚葉異形成症と診断された。
PGDやPGSの分野でのNGS技術の利用は徐々に進化しており.胚の異数性だけでなく.単原性疾患も検出できることもNGS技術の最大の利点です。 これは.他の技術ではまだ実現できないことです。
4.倫理的配慮
PGDやPGSは.従来の出生前診断に伴う流産や誘発流産を回避することができますが.実用的な臨床応用にはまだ多くの問題があります。 PGDやPGSは.胚に侵襲的操作を加えて最終診断を行うため.多くのサンプルの子孫を長期にわたって追跡調査する必要があるのです。 また.PGD時の胚の放棄をめぐっては.多くの論争があります。 例えば.X連鎖性劣性障害の性スクリーニングでは.健常な男性胚の半分を廃棄し.女性キャリア胚の半分を保持するが.常染色体劣性障害では.ヘテロ接合体胚を移植するかどうかで論争がある。
また.一部の家族性腫瘍（家族性大腸ポリポーシス.乳癌など）の感受性解析.血液疾患の既往のある子供を救うためのHLA選択など.PGDの適応をめぐって論争が起こっている。
PGDに先立つ遺伝カウンセリングの重要性は言うまでもない。ESHREが2009年に収集したPGDに関するデータを分析したところ.PGDの平均妊娠率はわずか23.04%であったという。 したがって.医師はPGDのプロセスとその結果について.成功したことを誇張するのではなく.客観的に説明することによって.患者に対してより好意的であるべきである。 カップルはPGDの誤診の可能性について明確に知らされるべきであり.また.妊娠した場合にはさらに通常の出生前診断を受けるようアドバイスされるべきである。PGDの診断は胚の母体への移植で終わるのではなく.出生前診断.さらにはその後の出産までフォローアップが継続されるべきである。 また.これらの赤ちゃんのフォローアップにより.患者さんの満足度も大きく向上します。
要約すると.単一細胞による遺伝子診断技術は急速に変化しており.PGDとPGSの分野が急速に進歩することにつながっている。 1978年のルイ・ブラウンの誕生は.ヒトの生殖補助医療の分野では画期的な出来事だったが.単一細胞遺伝子診断の急速な発展は.遺伝性疾患のリスクの高い多くのカップルに新しい希望をもたらしている。 近年.欧米ではPGDやPGSに関する技術的なガイドラインや勧告が策定され.中国の衛生家族計画委員会は「生殖補助医療機関における着床前胚遺伝子診断のためのハイスループット遺伝子配列の試験的臨床応用に関する通知」を発表し.関連当局も詳細な技術仕様の策定に乗り出しています。 単細胞遺伝子診断技術の継続的な開発・改良により.遺伝性疾患のリスクの高いカップルがより多くその恩恵を受けると考えられています。