膵臓癌におけるTLR9の発現と臨床的意義
WU Hanqing ZHU Shi-kai ZHANG Jian-jun YANG Zhi-yong WANG Chun-you WU Heshui*.
[概要】 目的 膵臓癌組織における TLR9 の発現を検出し.その臨床的意義を探る。 方法 Real-time quantitative PCR.immunoblotting.免疫組織化学を用いて.膵臓癌30組織とその隣接する腫瘍随伴組織.正常膵臓10組織におけるTLR9の発現を検出し.膵臓癌組織におけるTLR9の発現と病理学的グレード.臨床ステージ.転移の関係を分析した。 結果 TLR9 mRNA増幅fold値は.膵臓癌組織で2.32（1.41-3.22）.腫瘍随伴組織で1.23（1.18-1.28）となり.両群間で発現に有意差が認められた（t=2.642, P=0.023）。 膵臓癌におけるTLR9タンパク質の陽性発現率は73.3%.傍癌組織では33.3%.正常膵臓組織では20%であり.減少傾向を示した（c2 =13.99, P=0.001）。 膵臓癌におけるTLR9の高発現は.腫瘍の分化度.TNMステージ.リンパ節転移と正の相関があった。結論 TLR9 は膵臓癌組織で高発現し.TLR9 の発現は腫瘍のグレードと関連していたことから.免疫機構を介して膵臓癌の発生過程 に関与している可能性が示唆された。 武漢連合医科大学病院救急医療科 呉漢青（Wu Hanqing)
Keywords】膵臓腫瘍.がん.TLR9
膵臓がんにおけるTLR9の発現とその臨床的意義
Han-Qing Wu, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Zhi-Yong Yang, Chun-You Wang, He-Shui Wu.
華中科技大学武漢校同済病院膵臓外科センター（中国・武漢） 430022
通信先：He-Shui Wu教授.Email:[email protected]。
[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore their clinical significance. Methods: The real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 in the pancreatic cancer, tissues near tumor, and normal pancreatic tissues which obtained during operation from 30 pancreatic carcinoma patients and 10 normal non-lump patient. The relationships with pathological grade, clinical stage, and metastasis of pancreatic cancer were statistically analyzed. Results The amplification value level of TLR9mRNA expression in human pancreatic tissues, paracancerous tissues were 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The TLR9の高発現は.腫瘍の分化の程度と有意に相関している。[Key Words】 膵臓新生物；がん；Toll様受容体9 Toll様受容体（TLR）は.新しく発見された古代の受容体ファミリーで.自然免疫に重要なだけでなく.特異的免疫.免疫寛容.ある疾患の予防や治療にも深く関連しています。 高発現しているTLR9は徐々に減少しており（c2=13.99,P=0.001）.高発現しているTLR9受容体は様々な悪性腫瘍の発生に関与することが明らかになった[1]。 TLR9はこのファミリーの重要なメンバーであり.B細胞や樹状細胞によるインターロイキン（IL）-12.IL-6.インターフェロン-γ.単球抑制タンパク質.金属タンパク質分解酵素など.多数のサイトカインやケモカインの発現を刺激することができる[2]。 高発現しているTLR9は多くの腫瘍で認められましたが.TLR9が膵臓がんの発生に関連しているかどうかは明らかではありません。 本研究の目的は.膵臓癌におけるTLR9の発現と膵臓癌の発生との関係を調べ.その臨床的意義を探求し.膵臓癌の治療に新たな基盤を提供することにあります。 データおよび方法 I. 臨床病理学的データ 膵臓癌患者から30個のヒト新鮮膵臓癌組織とそれに対応する傍癌組織（腫瘍縁にしたがって1-2cm）を.他の理由で膵臓部分切除を必要とした非腫瘍患者から10個の正常膵臓組織標本を入手した。 術後の病理検査で.術前の放射線治療や化学療法が行われていないことが確認されました。 標本は外科的切除後すぐに二重に採取し.一つはすぐに液体窒素に入れ.その後-80℃で保存した。 40人のうち19人は男性，11人は女性で，年齢は39〜75歳，平均年齢は57歳であった。 腫瘍の病理組織学的悪性度：高分化型12例.中低分化型18例。 リンパ節転移が10例.非転移が20例。 II. リアルタイム定量PCRによるTLR9遺伝子発現の解析 Trizol kit（シグマ）の説明書に従って組織RNAを抽出し.UV分光光度計でRNAの純度と濃度を測定した。その後.ReverTra Ace（東洋紡）を用いた逆転写によりcDNAを合成した。プライマーはGenBankヒトTLR9 mRNA配列に従って設計し.TLR9プライマー配列は上流の： 5´-． GCCCAAATCCCTCATCCC-3´.下流：5´-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3´.増幅産物113bp。内部基準β-actin用プライマー.上流：5´-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3´.下流：5´-GCGCCATCATCATCATTCTA-3´。 TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3´.190bpの増幅産物（上海生物技術服務有限公司）。 増幅曲線反応手順：50℃ 2分.95℃ 2分.その後95℃ 15秒の変性.15秒のアニーリング.72℃ 45秒の伸長.合計40サイクルの反応。 膵臓癌または対応する傍癌組織のΔCT＝CT（標的遺伝子）-Ct（β-actin）.正常膵臓組織10個のΔCT＝ΔCT実験-ΔCTコントロールとし.正常膵臓組織10個のΔCTの平均値をコントロールとして使用した。 増幅倍率は.計算＝2-ΔΔCTで求めた。 III.イムノブロッティングによるTLR9タンパク質発現の検出 組織タンパク質の抽出は常法により行い.タンパク質濃度は Komas Brilliant Blue 法により測定した。 タンパク質15μlを10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にとり.ニトロセルロース膜に電気泳動し.5%スキムミルクパウダーで非特異抗原を封じ.ウサギ抗ヒトTLR9モノクローナル抗体（セルシグナル社）1：750希釈品を加え.4℃で一晩インキュベート.膜は 0.1%Tween 20を含むTBSTで洗浄.ホースラディッシュ・ペロキシダゼ（HRP）を添加しました Goat抗ラビット二次抗体を室温で2時間インキュベートし，メンブレンを洗浄後，強化化学発光基質ECL Plus試薬を加え，xフィルムに30秒間露光し，定常的に現像・固定した。 電気泳動ゲル画像自動解析ソフトウェア（Band scan v5.0）を用いて画像をスキャンし.解析した。 IV.免疫組織化学的手法によるTLR9タンパク質発現の検出 を.免疫組織化学キット（Wuhan PhD Co., Ltd.）の説明書に従って.免疫組織化学SP（Streptavidin-perosidase）法により測定した。 ポジティブコントロールとして既知のTLR9陽性肺がん組織[3]の切片を用い.ネガティブコントロールとして一次抗体の代わりにPBSを使用した。 顕微鏡下で.茶黄色に染色された細胞を陽性とし.染色物質は主に腫瘍細胞の細胞質に存在する粒状または薄片状であった。 染色結果は.腫瘍の縁や壊死部を避けて高倍率の10視野を無作為に観察し.発色の強さと染色の割合により半定量的解析を行い.陽性染色の程度により.0：陰性.1：弱陽性.2：中陽性.3：強陽性に分類された。 陽性染色の割合は.染色がない場合を0.全陽性細胞が25％未満の場合を1.全陽性細胞が25％以上49％未満の場合を2.全陽性細胞が50％以上の場合を3に分けた。 2つのスコアを合計し.0～1がネガティブ（C）.2～3が弱ポジティブ（）.4～5がポジティブ（）.5以上が強ポジティブ（）であった。 ()で高発現.(C)で低発現を表す。 V. 統計手法 統計解析ソフトウェアSPSS 13.0を用い.t検定.χ2検定.フィッシャーの正確確率法.順位和検定を適用し.数値間の差と相関を解析した。 α=0.05を検定水準とし.P<0.05を統計的に有意な差として算出した。 結果 1 リアルタイム定量PCRの結果 TLR9 mRNAとβ-actin mRNAは.正常膵臓組織.膵臓癌組織.副癌膵臓組織で発現していた。 正常膵臓組織のTLR9 mRNAをコントロールとした。 膵臓癌のTLR9 mRNAの増幅fold値は2.32（1.41~3.22）.腫瘍随伴組織のそれは1.23（1.18~1.28）で.両群間の発現差は有意（t=2.642.p=0.023）であった。 2 イムノブロット結果 図1に見られるように.内部基準であるGAPDHタンパク質の発現は.正常膵臓組織と同様に.癌および傍癌組織においても.36kDaのタンパク質バンドと130kDaのTLR-9が観察された。 癌組織におけるTLR9の発現は.対応する傍癌組織および正常膵臓組織に比べて.有意に高いことが示された。 図1 TLR-9タンパク質のイムノブロッティング結果（1：正常膵臓.2：傍癌膵臓組織.3：膵臓癌組織） 3 免疫組織化学的結果 TLR9タンパク質は主にがん細胞の細胞質に発現しており.褐色または茶色に均一に染色されていました。TLR9タンパク質の発現は.傍がん組織や正常膵臓組織の細胞質にも認められますが.淡黄色で膵臓がん組織よりも頻度は低くなっています（図2）。 10/30）と73.3％（22/30）であり.群間で統計的に有意な差があった（χ2=13.99.P=0.001）（表1）。 正常膵臓組織ではTLR9の高発現は認められなかったが.膵臓癌組織では73.3%（22/30）がTLR9タンパク質の高発現を示した。 膵臓癌30組織におけるTLR9タンパク質の高発現は.腫瘍の位置や大きさとは関係なく（P>0.05）.腫瘍の分化度.TNMステージ.リンパ節転移と関連していた（P<0.05.表2）。 図2 膵臓がん組織.副がん膵臓組織.正常膵臓組織におけるTLR9タンパク質の発現（×200）；膵臓がん組織（A）.副がん膵臓組織（B）.正常膵臓組織（C） 表1 正常組織.腫瘍随伴性組織.膵臓癌組織におけるTLR9タンパク質の発現量 一団 例 TLR9 タンパク質陽性 陽性率(%) ポジティブ ネガティヴ 正常組織 傍癌組織 膵臓がん組織 10 30 30 2 20 22 8
10 8 20.0 33.3 73.3 表2 膵臓がん組織におけるTLR9高発現と病理学的パラメーターとの関係 臨床的特徴 症例数 TLR9の高発現陽性 TLR9高発現陰性 陽性率(%) P値 腫瘍部位 膵臓の頭 膵臓尾部 20 10 15 7 5 3 75.0% 70.0% 1.00 腫瘍の大きさ ≤3cm以下 >3cm以上 17 13 13 9 4 4 76.5% 69.2%の 0.68 分化度 高度に差別化された じゅんこうぶんせき 12 18 6 16 6 2 50.0% 88.9% 0.034 TNMステージ І CП Ш- 13 16 7 15 6 1 53.8% 93.8% 0.026 リンパ節転移 ノー がありました。 20 10 13 9 7 1 65.0% 90.0% 0.024 注）統計解析には.χ2検定.フィッシャーの正確確率法を適用した ディスカッション TLRは.特定の種類の微生物が持つ保存された分子成分.すなわち病原体関連分子パターン（PAMP）を認識する.新しく発見された病原体パターン認識受容体です。1997年にMedzhitov [4] らによって.初めてヒトToll TLR9はTLRファミリーの重要なメンバーであり.細菌およびウイルスのDNAまたは合成オリゴヌクレオチド中のCpGモチーフを特異的に認識する（TLR1-TLR11と命名された）。 オリゴデオキシヌクレオチド.CpG-ODN）[5].TLR9は.外因性CpG DNAによる自然免疫の活性化を媒介する重要な生物学的意義を持っています。抗感染作用に加えて.TLR9は自己免疫疾患と悪性腫瘍の発生にも関連しています[6]。 TLR9を含むTLRによって誘導されるシグナル伝達経路が腫瘍形成に重要な役割を果たす可能性が示唆されており.TLRの発現上昇が胃がん.腸がん.肺がんの発生・進展に密接に関係している可能性が指摘されています[7]。
また.腫瘍におけるTLR9の発現は.腫瘍の化学療法や免疫療法に新たなアプローチをもたらす可能性があることも明らかにしました。
しかし.膵臓がんにおけるTLR9の発現や役割については.ほとんど知られていません。 本研究では.膵臓癌腫瘍組織において.TLR9を遺伝子レベルおよびタンパク質レベルで検出するとともに.TLR9タンパク質のサイズを測定し.傍癌膵臓組織および正常膵臓組織と比較しました。遺伝子レベルの結果では.TLR9 mRNAは膵癌組織.傍癌膵臓組織および正常組織で発現していましたが.癌組織で最も発現量が多く.非癌組織と比較して有意に高く（P<0.05 ). 免疫組織化学的染色像では.TLR9は膵臓腺癌の細胞質に優位に発現しており.膵臓腺癌組織ではTLR9陽性発現率が傍癌や正常膵臓組織よりも有意に高く.これは肺癌におけるDroemannの研究［3］の陽性相関結果と一致しています。 膵臓がん組織におけるTLR9の高発現は.患者の年齢.性別.腫瘍の位置や大きさには関係なく.腫瘍の分化の程度.TMNステージ.リンパ節転移や遠隔転移と関連していたことから.TLR9受容体は正常膵臓組織の成長や発達などの生理的機能だけでなく.膵臓組織の悪性化過程にも関わっていると考えられる。Schmausser [8] らによる研究では.その意義が確認されている。 TLR9は他のTLRとともに胃がん発生に関与する。 今回の研究結果は.これと矛盾しない。 近年.CpG ODNが主にTLR9に結合し.IFN-7やIL-12などのTh1極性サイトカインの分泌を誘導してTh0細胞からTh1への分化を促進し.Th1方向に強い免疫アポトーシス作用を持つことが多くの研究で確認されています。 例えば.CpG DNAは配列非依存性受容体介在エンドサイトーシスにより樹状細胞に入り.リソソーム領域でTLR9と特異的に相互作用し.IRAK1.IRF7.TRAF6.MAPK.核因子-KB（NF-KB）経路および関節分子MyD88を介して下流のシグナル経路を活性化します[9]。 本研究では.膵臓がん組織におけるTLR9を遺伝子レベル.タンパク質レベルで調べるとともに.TLR9タンパク質のサイズも調べました。 これらの成熟した抗原提示細胞は.共刺激分子（CD80.CD86）.ケモカイン受容体CCR7を発現し.Th1型サイトカインを分泌し.NK細胞を活性化し[10].さらに好中球表面のFc受容体の発現が増加し細胞障害活性が高まることにより血漿細胞様細胞と樹状細胞が成熟して抗原提示を行うようになります。 CpGとTLR9の作用により.Dc細胞などの抗原提示細胞は外来抗原を交差提示し.それによってCD8+ T細胞.NK細胞.マクロファージの活性化を交差活性化し.Th1タイプの免疫応答を生成し.自然免疫応答を活性化することができる[11]。 そして現在.CpG ODNは.ヒト肺腺がんA549細胞にTLR-9を介して強いThl型免疫反応を誘導する免疫アジュバントとして用いられており.腫瘍の治療における単剤療法または免疫療法のアジュバント療法として応用できる可能性があります[12]。 膵臓がん組織におけるTLR9の高発現は.腫瘍治療の新たなターゲットとなる可能性を示唆しています。TLR9タンパク質の発現は.膵臓がん細胞の悪性度やリンパ節転移の有無と相関し.膵臓がんの治療や予後を考える上で参考になります。 TLR9関連リガンドであるCpG ODNを用いた膵臓癌の免疫療法は.膵臓癌治療の新たな治療法の可能性をもたらすと考えられます。 参考までに。 1. Jurk M, Vollmer J. Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation[J]（合成CpGオリゴデオキシヌクレオチドの免疫調節への治療応用）。 BioDrugs,2007;21(6):387-401. TLR9はTLR4と協調してマウス樹状細胞によるIL-12放出を増加させる[J]。 Molecular Immunology,2008;45(1):244-252. 3.Droemann D, Albrecht D, Gerdes J ,et al. ヒト肺がん細胞は機能的に活性なToll様受容体9を発現している[J]。 Respir Res,2005,6(1):1-10。 4. Medzhitov R, Preston - Hurlburt P, Janeway CA. Drosophila Toll proteinのヒトホモログは適応免疫の活性化をシグナルする[J]。
Nature, 1997, 388: 394C397. 5.辺見秀樹.竹内 修.河合俊哉.他：Toll様受容体は細菌のDNAを認識する[J]。 Nature,2000, 408(6813):740. 自然免疫におけるDNAの認識とその制御[J]。Trends Immunol, 2006 Nov;27:525-532. 7.Coussens LM , Werb Z. Inflammation and cancer[J] . Nature , 2002; 420 (6917): 860-867. 8. Schmauber B, Andrulis M, Endrich Med Microbio, 2005,295(3):179-185. 9.アンダーヒルDM.トール-ライク・レセプター：成功のためのネットワーキング[J]。 Eur J Immunol , 2003 ,33 (7) :1767. 10.バラス Z. CpGオリゴデキシヌクレオチドによるNK細胞活性の調節[J]。 Immunol Res,2007;39(1-3):15-21. Krieg AM. Toll-like receptor 9 活性化の治療的可能性[J]。 Nat rev drug disc, 2006, 5:471-484. 12.クリーグ AM. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer[J]. Oncogene, 2008; 27:161-167. この記事は.Chinese Journal of Pancreatic Diseases, Vol.3, 2011に掲載されました。 本研究は.中国国家自然科学基金会（助成番号30200272）の支援を受けて実施した。著者略歴：Wu HQ, M, PhD, 主に膵臓腫瘍を対象としている。E-mail:[email protected]。 通信は.Wu Heshui.教授と博士のスーパーバイザー.ユニオン病院.同済医科大学.華中科技大学.武漢430022.中国に宛てたものです。Email:[email protected].