大腸がんは英国で最も多く見られるがんの一つで.毎年4万人が新たに診断され.5年生存率は55％.転移した患者の23％しか治療前の病期データが得られず.手術を受けても15％の患者は再発転移を起こすと言われています。
大腸がん治療における重要な進展は.セツキシマブ.ベバシズマブ.パニツムマブなどのEGFRを標的とするモノクローナル抗体の出現である。 利用可能なデータは.抗EGFR療法がKRAS変異型大腸がんに無効であることを明確に示しています。
KRASコドン12および13に限定した初期のデータでは.セツキシマブ治療が無効かどうかを予測することができ.NICEはこの試験結果を実際に使用するよう推奨しています。 セツキシマブは肝転移性大腸がんにのみ使用し.この治療法の適応を判断する際にはKRASコドン12および13変異の検査を行う必要があります。
KRAS検査は.抗EGFR療法を受ける患者を層別化するために日常的に行われるようになっています。 英国外の他の団体も.大腸がん治療においてKRAS遺伝子検査を推奨しています。
JCP誌に掲載されたWong博士の論文は.英国での臨床実践の指針となることを目的としており.大腸がんにおけるNRAS検査も取り上げ.特に検査の実際的な意味を重視して.大腸がんにおけるRAS検査に影響を与えた技術や研究についてもレビューしています。 記事の順番は.RAS試験片の試験手順に準じています。
ケース選択
定期的またはオンデマンドの検査
大腸癌のRAS検査をルーチンに行うべきか.オンデマンドで行うべきかは.まだ議論の余地がある。 ルーチン検査モデルとは.外科的に切除されたすべての検体をルーチンに遺伝子検査し.その結果を病理報告書に記載することを意味します。 将来.ある患者さんが抗EGFR療法を必要とした場合.この分子データをすぐに利用することができるのです。
定期的な検査は.KRAS遺伝子の検査時間が長くなることに対する良い解決策です。 検査時間が長いのは.分析方法に原因があるのではなく.適切な組織のスクリーニングに時間がかかっているためです。 また.定期的な検査により.組織ブロックの紛失.不適切に保管された組織ブロックの損傷.他の検査に使用したためにRAS検査ができなくなることを防ぐことができます。
ルーチン検査の欠点は.決して転移を起こさない患者さんには必要ないことです。 不必要な検査を減らすには.脈管侵襲.リンパ節転移.病理学的T4病期などの転移の危険因子が高い大腸がん検体を特定することである。
ルーチン検査の最大の欠点は.新しいデータでは.RASはKRASのコドン12と13の変異だけではないことが示唆されていることである。 もし.患者さんが抗EGFR療法を受ける予定で.以前にKRASコドン12と13の検査を受けた場合.今度はNRAS変異と追加のKRAS変異の検査も受けることになります。
最近の研究では.抗EGFR療法への耐性に関連する遺伝子が増えており.新しい標的療法が登場しています。 オンデマンド検査は.症例が多職種で検討され.該当する治療を受けることが決定された場合にのみ実施されます。 本稿執筆時点では.英国の検査施設による転移性大腸がん患者へのRAS検査は保険適用のみとなっており.英国ではオンデマンド検査が主流となっています。
英国における RAS 検査の利用可能性を向上させるためには.利用可能な資源の配分を合理化し. より合理的な検査システムを開発し.大腸がん組織へのアクセスを改善し.オンデマンド検査のための検体 をタイムリーに提供できるようにすることが重要である。
原発性または転移性組織
KRAS変異が原発性あるいは転移性大腸癌の組織で一致しているかどうかは.多くの研究で検討されている。 あるメタアナリシスでは.94.1％という非常に高い一致率を示しました。 しかし.この一致は解剖学的部位と関係があり.肺転移やリンパ節転移は原発部位との一致が少ないことを示唆するデータもある。 また.上記のメタアナリシスでは.リンパ節転移と原発性大腸癌の一致率は81.3％であることが示された。
原発巣と転移巣の間には絶対的な遺伝的一致がないため.転移性大腸がんの組織が入手可能で.できるだけ早く検査施設に届けることができれば.転移性大腸がんの組織を検査することが望ましい。 転移組織が容易に入手できない場合は.原発巣からの組織を送るべきである。これは.転移組織がRAS遺伝子検査においてより特異的であるという証拠が現在までに不十分であるためである。
試料の種類
RAS検査には.HE染色や免疫組織化学染色による切片など.病理組織学的あるいは細胞学的な検体を使用することができる。 内視鏡検体や肉眼針生検体など.検体採取技術の関係で検体が限られているものもあり.切除検体の場合は複数の腫瘍検体がありますが.通常は代表的な組織検体を1つだけ選択して検査します。 標本数が限られているため.検討すべき点がいくつもある。
腺腫のみを含む生検標本
一つは.臨床的にも画像的にも大腸がんが明らかであるが.内視鏡生検標本が腺腫のみで.RAS検査に使用できる標本がそれしかない場合である。 このとき.どうすればいいのか。 腺腫の検体は検査すべきではなく.原発巣または転移巣を再 生検するべきだという意見もあれば.腺腫を検査し.変異が確認されれば報告すべきだが.変異がない場合.腫瘍が変異していないことを証明するものではなく.やはり再生検が必要であるという意見もあります。
第二のアプローチは.RAS変異は通常腫瘍形成の初期に起こり.重要なドライバー変異であること.腺腫にRAS変異が存在することを証明することは.腺腫から発生する大腸がんもこの変異を有する可能性を示唆するという事実に基づくものである。 しかし.RASの変異は大腸発がんの後発事象である可能性もあり.腺腫はRAS野生型.腺癌はRAS変異型である可能性があることを意味している。
3つ目のアプローチは2つ目と同様.がんに近い状態である高悪性度の異質な過形成を伴う腺腫を検査するものです。
腫瘍内の変異の異質性
もう一つの疑問は.切除した検体が複数ある場合.どれを選べばいいのか.ということです。 このテーマは.腫瘍の突然変異の不均一性.すなわち同じ大腸がんでも異なるクローンの遺伝的表現型が一貫していない可能性に関連するものである。 内視鏡検体は通常.限定的で表面的なものであり.変異体クローンが腫瘍の深部に存在する場合は検出されないことがあり.また.変異体クローンが特定の組織塊内にのみ存在する切除検体である場合は検出されないことがある。
最新のKRASおよびNRASのデータに基づいて.一般に.いずれか一つのRAS変異の存在は.抗EGFR療法に対する耐性を予測するのに十分であると考えられています。 同じ大腸がんで複数のRAS変異が共存していても.それ以上の臨床的意義はない。
より臨床的に重要なのは.同じ腫瘍にRAS変異型と野生型の両方のクローンが存在することで.特に変異型クローンの割合が低い場合である。 後者は.大腸癌の DNA 抽出液にはごく一部の RAS 変異遺伝子しか存在しないため.変異のレベルが低いことを意味し.組織中の悪性腫瘍細胞が少ないために非悪性腫瘍細胞の DNA に変異遺伝子が希釈されることと区別する必要があるものと思われる。
また.同じ大腸がん組織内でもKRAS遺伝子型のバリエーションがあることを示唆するデータもあります。 大腸がんのごく一部は.野生型とKRASエクソン2および3変異型クローンが混在しており.この遺伝子型の変異は小さい：10/13検体では.特定のKRAS変異型クローンが腫瘍の80%を超えている。
最近の研究では.高解像度の溶解曲線解析を用いて.内視鏡と切除標本のペア30例のKRAS変異を調べ.それぞれのペアで遺伝子型が同一であることを明らかにした。
Sanger sequencingやreal time-PCRで同定された野生型大腸がんの7-20％は.ピロリン酸塩法.Therascreen check kit.標的核酸PCR.変異増幅PCRで再検査したところ.KRASコドン12と13に変異を認めた。 このレベルのKRAS変異を持つ大腸がんに対する抗EGFR療法の有効性については.まだ検討する必要がある。
特に.腫瘍内の突然変異の不均一性の研究は.より感度の高い検査の登場により進歩する可能性があり.ガイドラインに沿って臨床作業を進めることができるようになりました。 切除標本と生検標本の両方が入手可能な場合は.組織ブロックを検査に優先させるべきである。生検組織しか入手できず.結果が野生型遺伝子型である場合.低レベルの突然変異を除外するために生検を繰り返すことを支持する証拠は現在不十分である。
変異検査は治療法の選択に影響を与えるだけでなく.より重要なことは.低レベルの変異の存在が.抗EGFR療法に対する将来の耐性を予測する可能性があるということです。 これらの変異体クローンは.最初は数が少なく.抗EGFR療法によって変異体クローンが過剰に増殖し.十分な数が存在するときに治療抵抗性として現れるとしばしば仮定される。
準備に影響を与える要因
組織標本作製において.どのような要因がその後の分子検査結果に影響を与えるかを詳述したレビューが発表されており.特に大腸癌の RAS 検査に関連するものは以下の通りである。
RAS遺伝子変異検査に用いられる大腸がん組織の多くは.ホルマリン固定生検や外科的に切除された原発巣から採取されたものである。 後者の標本の固定は.主に大腸の剥離や洗浄が不十分であったり.部分的にしか固定されていない標本が採取されたりするため.しばしば遅延したり.固定不良になったりする。
固定が遅れたり不十分だと.アポトーシスやネクローシスによりDNAが分解され.長時間のホルマリン浸漬も過度の架橋によりDNAが分解され.突然変異検出の感度が下がり.失敗する確率が高くなる。 また.ホルマリン固定はシトシンの脱アミド化を引き起こし.人為的な突然変異の検出につながることがあります。
英国ではBouin固定剤はもはや一般的ではなく.以前の組織ブロックはBouinで固定されていることがあります。 ブロック内の組織が完全に黄色に変色している場合や.組織にDNA抽出工程からの溶出物が含まれている場合は注意が必要です。 ブアン固定された組織は.分子検査で失敗する確率が高い。これは.組織の保存期間が長いこともあるが.ブアン固定液の成分の中には核酸の分解を促進するものがあるためである。
病院によっては.内視鏡生検標本を固定する前に.標本を酢酸片に固定することが慣習となっており.酢酸片を除去しないと.DNA収量がさらに低くなることがある。 腫瘍細胞の含有量を記録することは.分子解析に適している。 DNAの酸化を抑えるために.組織は切除後できるだけ早く抽出する必要があるため.DNA抽出のために組織を切片化する場合と直接切断する場合の技術的な違いはない。
悪性細胞の含有量
体細胞変異組織が悪性細胞と非悪性細胞の両方を含む場合.悪性細胞含有量を正確に定量することが重要である。 最終的なDNA抽出液中の悪性腫瘍細胞DNAの割合は.全核酸の病理組織における悪性核酸の割合の良い指標となり.腫瘍が占める面積の割合を測定することが望ましい。
特に大腸がんでは.壊死した部分や無細胞の部分をカウントしてはならず.可能な限り除去することが重要です。 異数性染色体は腫瘍によく見られるもので.検出の感度を上げたり下げたりする可能性があります。 この論文では.突然変異を検出するために使用する腫瘍細胞の最小数は.検査した腫瘍細胞の最小数の2倍であるべきであると推奨しています。
例えば.ある方法が5％以上の腫瘍細胞を必要とする場合.組織中の10％以上の悪性細胞が変異検査に適切であると考えられる。 大腸癌の腫瘍細胞量の観察者評価にはばらつきがあるため.研究室では安全な腫瘍細胞量の最小値を用いて解析したいと考えているが.この比率はさらに検証する必要がある。