I. ABC法（SP法.LSAB法.SABC法と同じステップ）
ABC（avidin-biotin comeplex）オバルブミン-ビオチン複合体法は.アフィニティ免疫組織化学技術に属し.オバルブミン-ビオチンが高い親和性を持つという生物的特性に従って.ビオチンとパーオキシダーゼを組み合わせて.次にオバルブミンとビオチンを加えてオバルブミン-ビオチン-パーオキシダーゼ複合体を作ることによって得られるものである。LSAB.S-P.SABCはオバルブミンの代わりに抗ビオチン蛋白鎖酵素.ABC複合体の代わりにペルオキシダーゼで標識した抗ビオチン蛋白鎖酵素（SA）を使用していますが.手順は同じですが.SAの分子量が小さく浸透性が良いため反応速度が速くなります。また.SAはビオチンに対して非常に親和性の高い結合部位を2つ持ち.それ自体にはビオチンが結合していないため.2次抗体上のビオチンと結合できるため.ABCよりも2次抗体上のビオチンと結合しやすく.感度が高く.使用前に複合体を混合する必要がなく.より簡便であることが特徴です。ABCは3ステップ法で.2次抗体はビオチン化IgG（またはIgM.IgAなど）.Fabフラグメントは1次抗体に結合するため.この場合は1次抗体とのマッチングが必要です。一次抗体がマウス抗体の場合.二次抗体は抗マウス（またはIgM.IgAなど）.二次抗体がウサギ抗体の場合.二次抗体は抗ウサギ（またはIgM.IgAなど）.さらにヒツジ.ラット.ウマなどの抗体も必要である。マウス.ウサギのユニバーサル2次抗体を使用する場合.1次抗体がマウス.ウサギの場合は分割する必要はありません。ABCはオバルブミンとビオチンの親和性が高いため.PAPの20〜40倍の感度があります。最後に.複合体上のペルオキシダーゼが発色剤と反応して着色沈殿を形成し.顕微鏡で観察することができる。ペルオキシダーゼの発色剤としては.水に溶けない茶色の粒子を形成し.アルコールで脱水しキシレンで透明化できるDABが最適で.AECを発色に用いると水に溶けた赤い沈殿が生じるため脱水できず.水溶性シーラーで密封するしかなく.長期保存には不向きである。
手順は以下の通りです。
1.スライスした脱脂を水につける。
2.内因性ペルオキシダーゼをブロック（198mlメタノールまたは水＋2ml30％H2O2）.室温にて。
室温で20分間。水で洗浄する。
3.抗原修復：(1) pH7.2 TBS bufferで3回洗浄.トリプシン消化37℃.30分。または（2）説明書に従って：蒸留水洗浄.マイクロ波修復20分.または電気炉加熱30分.またはガス3分.急冷のキャップ付きオートクレーブ内の抗原修復液（Ph6.0）に入れ.または（3）説明書に従って：処理なし）。
4.pH7.2 TBSバッファー洗浄3回。
5.正常血清を一滴一滴37℃.30分追加します。
6.余分な血清を振り落とし.一次抗体を添加 37 ℃.30 分。その後.一次抗体を30分かけて添加します。
7.pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄します。
8.2次抗体を滴下し.37℃.30分。
9. pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄します。
10. ABC complexを滴下し.37℃.45分。
11.pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄します。
12.DAB発色.3～10分。
13.水洗。
14.ヘマトキシリン光染色.ブルーイング.脱水.透明化.封入。
II. PAP法
ステップ。
1.水へのセクション脱脂
2.内因性ペルオキシダーゼをブロック（198mlメタノールまたは水＋2ml30％H2O2）.室温にて。
温度で20分間。水で洗浄する。
3.抗原修復：(1) pH7.2 TBS bufferで3回洗浄.トリプシン消化37℃.30分。または（2）説明書に従って：蒸留水洗浄.マイクロ波修復20分.または電気炉加熱30分.またはガス3分.急冷のキャップ付きオートクレーブ内の抗原修復液（Ph6.0）に入れ.または（3）説明書に従って：処理なし）。
4.pH7.2 TBSバッファー洗浄3回。
5.正常血清を一滴一滴37℃.30分追加します。
6.余分な血清を振り落とし.特異抗体を一滴ずつ37℃.30～60分または4℃.一晩加え.ウェットボックスに入れる。
7.PBS洗浄。
8.2次抗体を1滴ずつ添加.37℃.30分。
9.pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄。
10.PAP抗体を37℃.30分添加します。
11.pH7.2TBSバッファー洗浄3回.DAB発色3～10分。
12.水洗。
13.ヘマトキシリン光染色.ブルーイング.脱水.透明化.封入。
III. APAAP法
APAAP。非標識抗体法に属し.特異性の高い抗アルカリホスファターゼ抗体を通して.抗酵素抗体にアルカリホスファターゼを大量に添加し.アルカリホスファターゼが抗酵素抗体に完全に結合して可溶性のAPAAP複合体を形成するように.よく使われる発色剤はBCIP/NT.赤固体または青固体である。特徴は内因性ペルオキシダーゼと反応しないので.バックグラウンドがきれいで.特に肝臓や腎臓などの内因性ペルオキシダーゼが多い組織に適しています。
手順を説明します。
1.切片を水に脱脂（凍結切片や細胞スミアはPBSに3分浸漬.抗原修復なし）。
2.内因性ペルオキシダーゼをブロック（198mlメタノールまたは水＋2ml30％H2O2）.室温にて。
温度で20分間。水で洗浄する。
3.抗原修復：(1) pH7.2 TBS bufferで3回洗浄.トリプシン消化37℃.30分。または（2）説明書に従って：蒸留水洗浄.マイクロ波修復20分.または電気炉加熱30分.またはガス3分.急冷のキャップ付きオートクレーブ内の抗原修復液（Ph6.0）に入れ.または（3）説明書に従って：処理なし）。
4.pH7.2 TBSバッファー洗浄3回。
5.正常血清を一滴一滴37℃.30分追加します。
6.過剰な血清を振り落とし.特異抗体の適切な希釈.37℃.60分.または4℃.一晩。
7.TBSまたはPBS（pH7.2）洗浄3回。
8.ブリッジ抗体.37℃.40分.または室温で1時間。
9.TBSまたはPBS（pH7.2）洗浄を3回行います。
10, 適当に希釈したAPAAP複合体を滴下し.37℃で30分間静置する。
11.TBSまたはPBS(pH7.2)で3回洗浄する。
12.AKP基質溶液を1滴ずつ加え.37℃で15–30分.陽性が透明に見えたら水で洗浄する。
13.再染色（核ソリッドレッドまたはヘマトキシリンまたはメチルグリーン）1-2分.定期的に洗浄した後.グリセロールゼラチンでフィルムを封鎖する。
IV. LDP（ラベル化デキストランポリマー）法（Envision 2ステップ法）
酵素標識ポリマー法は.酵素標識ポリマー技術の応用で.EnVison検出システムのように.グルコースポリマーに西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼを標識し.二次抗体とライゲーションしてEnVison二次抗体を形成させ.PowerVision検出システムのように.アミノ酸フラグメントに西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼを標識して使用する方法である。ポリマー上の20以上の部位が一次抗体と結合でき.ポリマー上の酵素の数が多いので.ABCやLSABなどの方法よりも感度が高い。最も重要なことは.LDPシステムの二次抗体にはビオチンが存在しないため.ABCやS-Pなどの方法で見られる内因性ビオチン結合との交差反応がなく.非特異的な発色が少なく.バックグラウンドがきれいであることです。
ステップ
1.セクションデワックスから水へ
2.0.3％H2O2メタノール溶液：内因性ペルオキシダーゼをブロック（198mlメタノールまたは水＋2ml30％H2O2）.室温で20分。水道水で洗浄。
3.抗原修復：(1) pH7.2 TBS buffer洗浄3回.トリプシン消化37℃.30min。または（2）説明書に従って：蒸留水洗浄.電子レンジ修復20分以内.または電気炉加熱30分.またはガス抜きキャップ付きオートクレーブ3分.急冷.または（3）説明書に従って：処理なし）抗原修復溶液（Ph6.0）に入れる。
4.pH7.2 PBSバッファー洗浄3回。
5.正常血清ドロップバイドロップを追加37℃.20分。
6.余分な血清を振り落とし.一次抗体を添加.37℃.30分。
7.pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄します。
8.Envision二次抗体を滴下し.37℃.30分。
9.pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄します。
10.DAB発色.3～10分。
11.水洗。
12.ヘマトキシリン光染色.ブルーイング.脱水.透明化.封入。
V. 二重染色法
1.水へのセクション dewaxing
2.内因性ペルオキシダーゼをブロック（198mlメタノールまたは水+2ml30％H2O2）室温で
20分。水で洗浄する。
3.抗原修復：(1) pH7.2 TBS bufferで3回洗浄.トリプシン消化37℃.30分。または（2）説明書に従って：蒸留水洗浄.マイクロ波修復20分.または電気炉加熱30分.またはガス3分.急冷のキャップ付きオートクレーブ内の抗原修復液（Ph6.0）に入れ.または（3）説明書に従って：処理なし）。
4.pH7.2 TBSバッファー洗浄3回。
5.正常血清37℃.30分滴下。 (なくても使用可能)
6.余分な血清を振り落とし.一次抗体を添加 37℃.30分。
7.pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄。
8.ビオチン化二次抗体を滴下.37 ℃.30分。
9.ビオチン化二次抗体を滴下.37℃.30分。pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄します。
10. ABCまたはS-P complex (horseradish peroxidase)を滴下し.37℃.45分間静置する。
11. pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄する。
12.DAB（茶色）またはAEC（赤色）で3~10分間発色させる。
13.pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄。
14.正常血清を滴下.37℃.30分（無添加可）。
15.余分な血清を振り落とし.2次抗体を添加 37℃.30分。
16.pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄。
17.ビオチン化二次抗体を滴下し.37℃.30分添加。
18. pH7.2 TBSバッファーで3回洗浄します。
19.アルカリホスファターゼ複合体を滴下し.37℃.30分。
20.pH7.2のTBSバッファーで3回洗浄します。
21.BCIP/NBT発色(青)
22.水洗
23.メチルグリーン再染色.脱水.透明化.密封。
もし西洋ワサビペルオキシダーゼを選択すると.DAB（茶）発色.西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とステップ21で.AEC（赤）発色とステップ23を選択できますが.それはAECが長い間保存できないことに注意する必要があります。あなたはアルカリホスファターゼのために別のを選択した場合.BCI / NBT.AP-赤.AP-オレンジ.BCI / NBT発色で使用することができます最高のものである。
VI。イムノゴールド法(IGS)
(1)切片は定期的に脱脂して水に浸す。
(2) 0.1%トリプシン溶液で37℃.10〜30分消化する。
(3)二重蒸留水洗浄を2回行う。
(4) 0.05 mol/L TBS PH7.4で10分間洗浄する。
(5) 1%オバルブミン閉鎖10分間。
(6) 室温で2時間.または4℃で一晩.特異的一次抗体をドロップワイズで添加します。
(7) 0.5 mol/L TBS PH7.4で3回洗浄します。
(8) 1%オバルブミンで10分間閉塞する。
(9)金標準抗体を37℃で45分間.希釈します。
(9) 0.05 mol/L TBS PH7.4で3回洗浄します。
(10) 二重蒸留水洗浄を2回行います。
(11) 1%Haldolを10分間。
(12)蒸留水洗浄を2回。
(13)再染色.グリセロール封入.観察。
結果。コロイド金結合部位は赤色である。
VII. イムノゴールド・シルバー法(IGSS)
(1)切片は定常的に水に脱脂した。
(2) 水銀含有固定剤で固定した組織切片は.0.5％ヨウ素アルコールで脱水銀し.0.5％チオ硫酸水溶液で脱塩し.流水で洗い.倍蒸留水で洗い.0.05 mol/L TBS PH7.4 solutionで洗浄した方がよい。
(3) 0.1%トリプシン水溶液で消化.37℃.10〜30分。
(4) 0.05 mol/L TBS PH7.4液で洗浄。
(5)1%オバルブミンで10分間クロージング。
(6) 適切な希釈率の特異抗体で.37℃で1～2時間.または4℃で一晩滴定する。
(7) 0.05 mol/L TBS PH7.4 溶液で3回洗浄します。
(8) 1%オバルブミン閉鎖を10分間行う。
(9) 金標識抗体の適当な希釈液で室温.37℃.45分間滴定する。
(10) 0.05 mol/L TBS PH7.2で3回洗浄します。
(11) 蒸留水で2回.二重蒸留水で2回洗浄する。
(12) 銀現像液に3～5分入れ.反応中は光を避けます。
(13)蒸留水洗浄。
(14)水道水洗浄.ヘマトキシリン光再染色。
(15) 脱水.透明化.封入.観察。
結果。特異抗体結合部位は灰黒色の粒子で.背景は透明な灰色.核は水色です。
試薬の調製。
銀の現像液。
1.硝酸銀の現像液。
（1）10％アラビアゴム水溶液 60ml.クエン酸緩衝液 pH3.510ml
(2)ハイドロキノン1.7gに二重蒸留水30mlを加えたもの。
(3)硝酸銀40mg＋2倍蒸留水2ml。
(1)と(2)の2液を完全に溶解して混合し.使用前に(3)を加え.暗所で現像する。
2. 0.05 mol/L TBS (pH 7.4)。
Tris 12.1g,
NaCl 17.5g。
よく撹拌して溶解し.濃塩酸でpHを7.4に調整した後.倍蒸留水を加えて2000mlとする。
この時.攪拌した溶液は.攪拌されずにそのまま放置されます。