抗リン脂質抗体（APA）は.抗カルジオリピン抗体（ACA）とループスアンチコアグラント（LA）を中心とする自己免疫抗体群で.妊娠損失の主要な免疫因子の一つです。 漢方薬が免疫調節に重要な役割を果たしていることは.研究により明らかにされています。 今回.まず動物実験により.APAによる妊娠ラットの妊娠損失に対して.補腎・活血の処方である丹匠湯の効果を観察した。 河南中医薬大学第一附属病院リプロダクションセンター 魏愛娃氏
材料と方法
1.動物 河南省実験動物センターから提供された10週齢のSPF級健康雌雄SDラット120匹（雌200g±10g.雄250g±20g）を使用した（適合証明書番号：0009881）。 雌雄ラットを1：1でケージに入れ.翌朝早く陰核栓または膣内塗抹標本に精子が認められたものを妊娠0日目とし.100匹のラットを登録実験動物とした。
2.薬物 腎を補う処方（｜絹実32g.川芎16g.桑16g.アガリクス16g）.血を元気にする処方（｜サルビア20g.｜根茎20g）.丹匠湯（上記2処方を合わせた）をヒトラットの重量比に合わせて換算し.生薬をそれぞれ1g/ml.0.67g/ml.0.34g/ml含む濃縮煎じ薬とした。 煎じ薬は.河南中医薬大学第一付属病院製剤部で調合されたものです。
3.ヒト血清の採取と精製
3.1 血清採取のためのエントリー基準
2007年3月C9月に河南中医薬大学第一付属病院外来・病棟に通院し.ELISA法による血液ACAが陽性.定量試験で中高値となった再発性流産患者.同期間に外来・病棟でモノクローナル抗体によるループス抗凝固活性が陽性の全身性エリテマトーデス（SLE）の患者.健常人の血清。
3.2 血清採取の除外基準
(1)ACAが陽性の患者は.他の原因による流産を除外する。(2)SLE患者.ACAおよび他の抗体が陽性の患者は除外する。(3)上記の3つすべて.および他の様々な疾患を併せ持ち.最近投薬治療を受けていない患者は除外し.患者の同意を得て血清を保有すべきである。
3.3 タンパク質溶液の精製と濃度の測定 タンパク質溶液を二次塩析により精製後.UV分光光度計により溶液のOD値を280nmで測定し.式：タンパク質質量濃度（mg/ml）=1.2×OD280nmを参照して溶液中のタンパク質質量濃度を求めました[1]。 質量濃度15 mg/mlのタンパク質溶液（75 mg/(kg・d)相当）に調製し.-20℃に小分けして保存した。
モデルの複製は.Holers[2]のモデリング手法をベースに修正を加えたものです。 各群50匹を2群に分け.各群を腎臓強壮・血液活性化群（A）.腎臓強壮群（B）.血液活性化群（C）.モデル群（D）.ブランク妊娠ラット群（E）に分類した。 A群にはACA精製蛋白液.C群にはLA精製蛋白液15mg/（ml・d）をそれぞれ妊娠8日目と12日目に皮下投与し.E群には同量の正常ヒト血清をそれぞれ妊娠8日目と12日目に皮下投与した。 妊娠15日目に全頭死亡した。
3.観察指標と検査方法
3.1 ラット血液中のACA濃度の測定 妊娠15日目に腹部大動脈から3mlの血液を採取し.血清中のACA濃度を酵素標識免疫測定法で測定し.OD 値を測定した。 (ACA enzyme immunoassay kit, made by Shenzhen Xaar Biotechnology Co Ltd, batch no. 20070721)。
3.2 マウス血液モノクローナル抗体によるループス抗凝固活性の測定 妊娠15日目に腹部大動脈から1.8mlの血液を採取し.活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）を用いてエンドポイント凝集法によりその活性を参考までに測定した[3]。 (半自動クロノグラフ.Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ；マウスモノクローナル抗体キットMABTEST.Adiatec SA, Diagnositic }Biotechnologies, LA, France.商品番号20070091）。
3.3 胚の重量測定 ウラタン麻酔後.マウス胚を開腹分離し.精密電子天秤で湿式重量を測定した。
3.4 胚取り込み率の決定文献[4-5]を参考に，胚取り込み率を算出した（胚取り込み率＝吸収胚数／吸収胚数＋未吸収胚数×100％）．
3.5 胎盤病理検査 胎盤の剥離部を4％パラホルムアルデヒドで24～48時間固定し.ルーチンにパラフィン包埋.切片化（厚さ4um）.ACA陽性妊娠喪失モデル群はHE染色.SP免疫組織化学染色.LA陽性妊娠喪失モデル群はHE染色.ハイビジョンカラー医療画像解析システムHMLAS-2000で画像取得を行った。
3.6 統計分析 分析には SPSS 13.0 ソフトウェアを使用し.すべてのデータはカイ二乗検定にかけられ.2 群間のデータには t 検定が使用された。
結果
1.ACA陽性およびLA陽性妊娠ラットの異なるグループにおける胚取り込み率.胚重量.ACAおよびLA活性の比較を表1および表2に示す。
D群と比較して.（1）胚取り込み率.ACA.APTT値はA.B.C群で低下したが（P<0.01）.3群のうちA群で低下が顕著であり（P<0.05）.E群とは統計的に有意な差はなかった。 (2) A群およびC群では胚重の有意な増加が認められ（P<0.01.P<0.05）.A群の胚重のみがE群から統計的に有意ではなかった（P>0.05）。 腎を補い.血を活性化させる処方が優れていることが示唆される。
各群のラット胎盤の病理組織学的観察 （1）免疫組織化学的切片 E群は褐色ACA免疫複合体の沈着を認めず.ACA妊娠喪失群 D群のラット胎盤組織には褐色ACA免疫複合体の沈着の程度が異なり.核の連結と核断片化が見られ.胎盤組織の変性と壊死を示唆している。B群およびC群はいずれもD群に比べて有意に改善し.A群は胎盤組織の変性と壊死は認められ なかった A群は胎盤組織の変性や壊死を認めなかった。 (2) HE染色病理切片 E群の胎盤組織は.構造が明瞭で血液洞が豊富で均一に配列されていた。LA群とACA妊娠喪失D群の胎盤組織は.変性と壊死の程度が異なり.栄養膜層に炎症細胞の浸潤が認められ.胎盤血管にフィブリン凝固と静脈うっ滞が認められ胎盤血液循環障害が考えられた。B群.C群ともにモデル群と比較して有意に改善した。A群は 胎盤の病理は.A群では基本的に正常であった。
表1 ACA陽性妊娠ラットの各群における胚吸収率.胚重量およびACAレベルの変化
グループ
妊娠したラットの数
エンブリオ・アップテイク率
胚の重量
ACAレベル OD値
グループA
10
0.03±0.03＊*
0.38±0.05＊*
0.10±0.03＊*
グループB
10
0.32±0.06Δ
0.19±0.05＊＊##△
グループC
10
0.10±0.04＊＊#
0.29±0.10＊△
0.22±0.04＊＊##△
グループD
10
0.21±0.09
0.23±0.04
0.32±0.05
グループE
10
0
0.39±0.06
0
注：D群と比較して.*P<0.05, **P<0.01；E群と比較して.△P<0.01
A群との比較.#P<0.05.#P<0.01
Table 2 LA陽性妊娠ラットの異なるグループにおける胚取り込み率.胚重量.LA活性の比較
グループ
妊娠したラットの数
エンブリオ・アップテイク率
胚の重量
APTT(S)
グループA
10
0.01±0.03＊*
0.42±0.03＊*
20.03±0.78＊*
グループB
10
0.08±0.07＊* #
0.34±0.06Δ
21.40±1.11＊＊ ## △
グループC
10
0.06±0.07＊＊ #
0.36±0.06＊△
21.31±1.18＊##△
グループD
10
0.19±0.06
0.32±0.04
24.34±1.31
グループE
10
0
0.43±0.04
19.86±0.95
注：D群と比較して.*P<0.05, **P<0.01；E群と比較して.△P<0.01
A群との比較.#P<0.05.#P<0.01
ディスカッション
流産.死産.子宮内発育遅延などの症状を示すことが多く.遺伝的.解剖学的.内分泌学的要因の他に.免疫的要因も密接に関係しており.APAはその一つである。 APAが妊娠損失を引き起こす正確なメカニズムはよく分かっていないが.多くの場合.血球凝集説が支持される傾向にある。 APAがプロスタサイクリンの合成を阻害し.トロンボキサン／プロスタサイクリン比の不均衡を引き起こし.血液凝固亢進や血栓症.特に胎盤循環を引き起こし.胎盤血栓症や胎盤梗塞を形成して胎盤低形成.胚吸収.子宮内発育遅延をもたらすことが動物実験で確認されています［6-7］。 臨床治療では.アスピリン.ヘパリン.プレドニンなどが主に使用されますが.これらの薬剤の副作用の可能性があるため.患者さんはパニック状態に陥ります。
漢方医学では.「流産」.「滑胎」.「成長しない胎児萎縮」.「腹上死する子」などは.現代医学の「妊娠失認」に近い言葉である。 現代医学では.「妊娠中毒症」という言葉が使われています。 漢方医学では.上記の病気は「打点」の損傷によって引き起こされるとされています。 腎は生殖を司り.子供を生む役割を担っているので.腎の欠乏が病気の根源となるのです。 しかし.腎に陽虚があっても温がない場合.あるいは陰虚と熱虚がある場合は.熱によって精血が焼かれ.血の停滞と不全が生じ.また流産を繰り返し.パンチやレンに傷があると.血の停滞が靭帯を塞ぎ.胎児が変位してしまうのです。 内経』では「四王盗骨一盧薬」が腎を補い血を活性化させる道を開いており.張西鈞は「腎気薬は腎を補う薬であるが.同時に瘀を開く薬でもある」と指摘し.腎を補うことと血を活性化させることが相互に補強し合う有機的結合であると考えたのである。 腎を補い.血を活性化させて胎児を落ち着かせることを原則とし.承平丸をベースにした丹匠湯に.丹参と神仙を加えた処方で構成されています。 この処方では，｜蟾酥と丹参を支配者とし，強壮と賦活を組み合わせ，互いに補い合う。｜相は，Fructus Parviflora と Radix et Rhizoma Polygonati を用いて腎を益し胎子を鎮め，固渋の機能を高め，血流を自由にする。；附子は Radix Aconiti を用いて丹参の活血と血流調節を助ける；トリカブトは血を補い血を止めて胎子を栄養し，活血して血を分散させるのを阻止する。 現代の研究はまた |Serum が卵巣黄体形成ホルモンの増加を促進し.体液性免疫機能を高め.免疫グロブリンの生産を抑制するエストロゲン様効果を持つことができることを示しました; 桑および sequestra は子宮および胚の開発にとって有利であるステロールおよびステロイドで豊富.子宮収縮の役割を抑制する; アガリクスはマクロファージの首都が Γ悪い魏 zhengdi 上院ファイルのウサギおよび希望にサポートするために改良できるいろいろ微量の元素を含んでいます。 また.腎臓のエネルギー源としても知られています。 その結果.補腎・活血の処方は.補腎・活血の処方単独よりもAPA価を下げる効果が高く.それによって胎盤微小循環の改善.胚吸収の抑制.ラット胚の重量増加.反復妊娠の成功率向上が期待できることがわかりました。
参考文献
[1] Lorne E, Lane D. Laboratory guide to antibody techniques [M]. 北京：科学出版社, 2002: 9.
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陳暁祥.楊成徳.顧悦英.他.プラスミンによる抗リン脂質抗体の実験的研究.Chin J Rheumatol.2006.10（6）：321-326。 :321-326
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Zhou Yue-Hua,Zhu Xiao-yong,LI Da-jin,et al. 妊娠初期のin vivo CD80/CD86 costimulatory signalの遮断が未熟児のcostimulatory molecules発現に与える影響について。堕胎モデルにおける免疫担当細胞の分子発現,Chinese Journal of Immunology,2004,20(8):537-543.
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Lin YiR,Zeng Yao-ying ,Zeng Shan et al .eduction of embryo resorption with macrophage toxin in CBA/J×DBA/2 Mice. Lin Yi,Zeng Yao-ying,Zeng Shan, et al. 済南大学校（自然科学）雑誌, 2002, 23(1): 93-98.
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王宰茂.傅栄州.唐樟泉.現代中国伝統医学臨床応用.北京：人民医療処罰院. 北京 :人民医療処罰院, 2005: 259-396 (自己言及)