トリプシノーゲンの最も重要な活性化因子はエンテロキナーゼであるが、特殊な場合には、エンテロキナーゼが欠乏した場合のトリプシンの自己触媒反応もトリプシノーゲンを活性化することがあり、また、酸や組織液がトリプシノーゲンを活性化してトリプシンになることもあり、そのような役割を果たすこともある。
トリプシノーゲンは十二指腸に入り、腸液中のエンテロキナーゼによって活性化され、トリプシンに変換される。 トリプシンはアルギニンとリジンのペプチド鎖を選択的に加水分解し、天然タンパク質、変性タンパク質、繊維状タンパク質、ムチンをペプチドまたはアミノ酸に加水分解する。
エンテロキナーゼは特異性の高いプロテアーゼであり、その特異性と加水分解効率の高さから、遺伝子組換え製品の開発において重要な役割を果たしている。