VEGFR-3は.VEGF-C/Dのチロシンキナーゼ受容体として働くFlt-4とも呼ばれ.主にリンパ管内皮細胞に発現しているほか.肝臓や脾臓の血液洞.外傷修復.腫瘍組織の新生血管内皮に存在する。 江蘇省立統合医療院産婦人科 Ma Xiaoping 最近の知見では.VEGFR-3の発現は腫瘍細胞自体にも存在し.様々な形で悪性腫瘍の進行に関与していることが示唆されています。 本研究では.早期子宮頸癌組織におけるVEGF-C.VEGF-D.VEGFR-3/Flt-4の発現を免疫組織化学的SP法により検出し.さらにVEGFR-3/Flt-4標識血管密度（MVD）を検出し.臨床病理因子との関連を分析し.早期子宮頸癌の進行過程にVEGFR-3/Flt-4の役割を考察した。 早期子宮頸癌の進行におけるVEGFR-3/Flt-4の役割について検討した。 1.材料と方法 1.1 対象 子宮頸癌の外科的切除例 41 例を選び.4%パラホルムアルデヒドで固定し.パラフィンに包埋した。 手術前に放射線治療を受けていない組織で.手術後に病理学的に確認された。 臨床病期は国際産婦人科連合（FIGO, 2000）の基準によるもので.Ia期7例.Ib期14例.IIa期20例.組織学的グレードはG17例.G2 13例.G3 21例.組織型は扁平上皮癌37例.腺癌4例.リンパ節転移あり15例.リンパ節転移なし26例.患者の年齢は26〜70才.中央値は42才。 年齢の中央値は42歳で.12例が閉経後.29例が閉経前であった。 顕微鏡で見ると，癌細胞はリンパ管の内腔に浸潤しており，35例はリンパ管浸潤を認めず，6例はリンパ管浸潤を認めた。 1.2 試験方法 1.2.1 免疫組織化学的SP染色 免疫組織化学的SPキットを使用し.説明書に沿って厳密に操作した。 組織ワックスブロックを5μmで連続切片化；キシレンは日常的に脱脂・水和；マイクロ波抗原熱修復（95℃，10min）.抗原修復液はクエン酸緩衝液（pH6．）；内因性過酸化酵素は3％過酸化水素-メタノール溶液で10minブロック；非特異抗体をブロックするのにヤギ血清10％を使用；一次抗体：ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体 VEGF-C（1：50． ZA-0266); ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体 VEGF-D (1:100, BA1461); ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体 VEGFR-3 (1:200, ab27278), 60分間インキュベート; 抗ウサギビオチン化二次抗体を滴下添加.30分間インキュベート; ホースラディッシュパーオキシドラベル鎖アフィティを滴下添加.30分インキュベーション；DAB顕微鏡展開, hematoxylin ネガティブコントロールとして.一次抗体の代わりにPBSバッファーを使用し.ポジティブコントロールとして既知の乳がん切片を使用した。 1.2.2 結果の判定 VEGF-C.VEGF-D および VEGFR-3/Flt-4 の陽性染色は.細胞質内に茶色がかった黄色の顆粒が存在することと定義され た。 Jüttnerらが報告した方法に従って.陽性細胞の割合を.-（陽性細胞なし）.+（0～5％陽性細胞）.++（5～50％陽性細胞）.+++（50％以上陽性細胞）に分けました。 MVDはWeidnerらによって報告された方法で決定した。陽性ルーメンの密集した領域.すなわち「ホットスポット」領域を低倍率で探し.高倍率で観察.カウントし.MVDは高倍率5フィールドの陽性ルーメンの平均数で表現した。 1.3 統計処理 すべてのデータは.統計ソフトウェア SPSS13.0 を用いて処理された。 測定データのMVDは±sで表した。P<0.05は統計的に有意な差とみなした。 2.結果 2.1 早期子宮頸癌組織における VEGFR-3 の発現 VEGFR-3/Flt-4 は.一部の血管内皮細胞に加え.リンパ管内皮細胞にも発現していた。 形態学的にVEGFR-3/Flt-4陽性の血管は.一部が血管.一部がリンパ管である。 陽性血管を取り囲む炎症細胞の一部にもVEGFR-3/Flt-4タンパク質の発現が見られ（図1A）.VEGFR-3/Flt-4陽性血管は主に腫瘍組織を取り巻く間質で認められた（図1B）。 VEGFR-3/Flt-4陽性の血管の一部には.がん細胞が含まれていることがわかった（図1C）。 腫瘍細胞では.VEGF-C.VEGF-D.VEGFR-3/Flt-4タンパク質の発現が認められ.それらの陽性発現率はそれぞれ48.7%（20/41）.58.5%（24/41）.63.4%（26/41）でした（図1D,E,F）。 図 1 早期子宮頸がん組織における VEGFR-3/Flt-4 の発現 2.2 早期子宮頸がん組織における VEGFR-3/Flt-4 蛋白.MVD.臨床病理学的因子と関連蛋白発現の関係 VEGFR-3/Flt-4 蛋白発現は子宮頸がん患者の生理状態.組織グレード.組織型とは関連がなく.臨床ステージ. リンパ節転移とは関係がない MVDは月経状態.組織学的グレード.組織型.リンパ節転移.リンパ管浸潤とは関連がなく.臨床病期.VEGF-CおよびD蛋白と関連があった。 表 1 早期子宮頸がん組織における VEGFR-3/Flt-4 と MVD.臨床病理学的因子と VEGF-C および D タンパク質発現の関係 3.考察 血管内皮増殖因子ファミリー VEGF-A, B, C, D および E とそれらの受容体 VEGFR-1, -2 および -3 は.血管新生またはリンパ管形成促進特性により悪性腫瘍の増殖と転移促進に役割を担っている。 VEGF-A.B.C.D.Eおよびそれらの受容体であるVEGFR-1.-2.-3が悪性腫瘍の増殖や転移を促進する役割とそれに対応する遺伝子治療戦略が研究のホットトピックになっています。 現在の研究では.腫瘍の血管新生は主にVEGF-A/VEGFR-2によって制御され.腫瘍のリンパ管新生は主にVEGF-CとD/VEGFR-3によって制御されることが示唆されています。 その結果.VEGFR-3/Flt-4はリンパ管内皮細胞だけでなく.一部の血管内皮細胞にも発現していることが判明した。 VEGFR-3/Flt-4陽性血管の形態は.一部が血管性.一部がリンパ性であり.VEGFR-3/Flt-4標識陽性血管密度MVDは臨床病期および関連タンパク質VEGF-C.Dと相関したが.月経状態や組織グレードなど他の臨床病理学的因子とは相関がなかった。 これは.安岡らの知見と異なる。 そのメカニズムは.VEGFR-3/Flt-4が腫瘍のリンパ管形成と血管新生の両方で重要な制御的役割を担っているためと思われます。 腫瘍細胞はVEGF-CとDを分泌し.リンパ管内皮細胞や血管内皮細胞のチロシンキナーゼ受容体VEGFR-3/Flt-4にパラクライン受容体として働き.内皮細胞の増殖.分化.ルーメン形成を媒介します。 一方.腫瘍組織内の血管の増加は.腫瘍細胞の増殖に必要な栄養分を供給し.他方.腫瘍組織内のリンパ管の増加は.腫瘍細胞の浸潤と転移の経路となり.転移の拡大を容易にする。 しかし.リンパ管の真の内皮細胞マーカーがないため.組織の種類や場所.さらには発生段階によってリンパ管の内皮細胞マーカーが異なり.腫瘍の血管新生とリンパ管生成におけるVEGFR-3/Flt-4の役割の正確なメカニズムについては.より深く研究する必要がある。 VEGF-C/Dの受容体としてのVEGFR-3/Flt-4は主に内皮細胞に発現していますが.最近の知見では.多くの腫瘍細胞自体もFlt-4を発現し.腫瘍の進行に重要な役割を担っていると考えられています。 多くのヒト悪性腫瘍の臨床研究において.腫瘍細胞におけるVEGFR-3/Flt-4の発現は.臨床病期.細胞分化の程度.リンパ節転移および患者の予後と相関することが示されている。 したがって.子宮頸癌の発癌過程におけるリンパ管形成促進表現型の変換に関与している可能性があると推測される。 in vitroの遊走・浸潤アッセイ試験の結果.子宮頸がん細胞株SiHa.乳がん細胞株MDA-MB-231.Hs578Tなど浸潤力の強い特定の腫瘍細胞は.VEGF-Cに加えてFlt-4を発現しており.ヒト遺伝子組換え体VEGF-Cタンパク質（Cys156Ser）は腫瘍細胞の遊走・浸潤能を促進できることがわかった。 Masoodらは.VEGFR-3/Flt-4が白血病細胞の増殖.生存.化学療法抵抗性の発現にも関与している可能性を示しました。 の生存と化学療法抵抗性形成に影響を与える。 本研究では.腫瘍細胞におけるVEGFR-3/Flt-4の発現は.子宮頸がん組織におけるリンパ節転移.リンパ管浸潤.患者の臨床病期と相関し.そのリガンドであるVEGF-CおよびDタンパク質の発現と相関することがわかった。 そのメカニズムは.腫瘍細胞がVEGF-CやDを分泌し.それが腫瘍細胞自身のVEGFR-3/Flt-4にオートクライン的に作用して腫瘍細胞の移動・浸潤を促進し.腫瘍リンパ管の浸潤やリンパ節転移につながり.腫瘍の進行に関与していると考えられています。 Jüttnerらの研究の結果.胃がん細胞におけるVEGFR-3/Flt-4の発現は.患者のリンパ節転移と関連性がないと結論づけられました。 患者におけるリンパ節転移 さらに.本研究の結果.VEGFR-3/Flt-4タンパク質の発現は.腫瘍組織を取り巻く間質中の一部の炎症性細胞にも認められたが.その役割は明らかでなかった。 腫瘍組織の間質に存在する炎症細胞も.腫瘍のリンパ管形成の過程で重要な役割を担っている可能性があることが示されている。 したがって.子宮頸部悪性腫瘍の進行におけるVEGFR-3/Flt-4の役割は多面的で.腫瘍の種類によって異なる可能性があり.正確なメカニズムについては.さらなる研究が必要であると推測されます。