甲状腺結節は最も一般的な内分泌疾患の一つですが.そのうち甲状腺がんになるのは5～15％程度です。 甲状腺がん（TC）は最も一般的な内分泌系悪性腫瘍で.全身の悪性腫瘍の1％.頭頸部の悪性腫瘍の91.5％を占めます[1]。 分化型甲状腺がん（DTC）は.甲状腺乳頭がん（PTC）や甲状腺濾胞がん（FTC）など.甲状腺がん全体の90％以上を占めますが.このうち分化型甲状腺がん（DTC）は.甲状腺がん全体の約半分を占めています。 調査によると.世界では毎年約122,800人の甲状腺がんが新たに発生し.その中でもPTCの発生率は著しく増加していることが分かっています[2]。 分化型甲状腺癌の予後はステージと密接に関係しており.早期診断が非常に重要です。
現在.甲状腺がんの早期診断には.超音波.CT.MRI.PET/CT.細針吸引生検（FNAB）など.多くの診断技術が用いられています。 通常.甲状腺がんの術前診断には.超音波ガイド下微細針吸引生検が最も有効な方法と考えられており.感度93％.特異度75％という報告があります[3]。 しかし.FNABには.結節の直径が1cm以下の場合.正確な病変組織を得ることが難しい.細胞や組織の量が限られている.侵襲的な検査であるなどの限界があります。 悪性病変がはっきりしない.あるいは疑われる患者の術後病理所見のうち.甲状腺癌はわずか20〜25％であり.さらに75〜80％の患者は不必要な甲状腺手術を受けている[4]。 非侵襲的な方法によるDTCの早期診断は.常に臨床上のホットスポットであり.課題でもありました。 近年.DTCの早期診断の向上を目的として.DTC患者の血清中の特定のタンパク質の発現変化を検出し.DTC腫瘍マーカーを見出す試みが数多くなされており.その中には応用が期待できるものもあります。
1.分化型甲状腺癌のターゲットフリー血清プロテオミクス研究
乳頭癌ではBRAFV600E変異.RET/PTC1遺伝子再配列.RAS変異.TRKなど.DTCでは多くの研究で遺伝子発現の異常が認められている[5]。濾胞癌ではNRASQ61R変異.BRAFK601E変異.PAX8/PPARG再配列.RAS変異.RET/PTC遺伝子再配列が確認されている[6]。 などがあります[6]。 これらの変異遺伝子は.コードされたタンパク質に異常をもたらすだけでなく.下流の関連するシグナル伝達経路の活性に変化をもたらし.経路関連タンパク質の翻訳や翻訳後の修飾に直接的または間接的に影響を与える可能性があります。 腫瘍タンパク質の違いを見つけて分析することで.DTCに特異的な腫瘍マーカーを特定できる可能性があります。 プロテオミクスには.マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF-MS）.表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（SALDI-TOF-MS）.表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（SALDI-TOF-MS）があり.現在は.この3つの質量分析計が一般的な手法として用いられています。 質量分析（SELDI-TOF-MS）.表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（SELDI-TOF-MS）などがあります。
Sofiadis A[7] (2010) とBecker S[8] (2012) は.DTCの診断モデルとして.SELDI-TOF-MSと二次元ゲル電気泳動法を用いて.DTC組織サンプルとコントロールサンプルのタンパク質発現の差異をそれぞれ解析しています。 しかし.組織中のタンパク質の違いは血清中のタンパク質の違いとは一致せず.また.腫瘍の早期診断のために得られる組織の量や性質は様々で.偽陰性を起こしやすいため.組織プロテオミクスは術前の早期診断には適さない。 血清サンプルは豊富にあり.血清の抽出は臨床の場で容易かつ迅速に行うことができます。 血清タンパク質は.豊富で（60C80 mg/ml）.多様である（数百種）[9]。 Lu Xuboら[10]（2006）は.甲状腺がん.良性甲状腺結節.健常者の3群それぞれで.血清タンパク質の発現に固有の違いがあること.血清プロテオミクス技術を使って.高い特異性と感度で血清タンパク質指紋モデルを確立できることを発見しています。 このことは.腫瘍と良性病変の血清の違いを分析できる血清プロテオミクスが.腫瘍の早期診断に有利であることを示唆している。
2002年に卵巣がんの血清関連タンパク質マーカーのスクリーニングにプロテオミクス技術を用いたことが初めて報告されて以来[11].プロテオミクス技術は.肺がん[12].すい臓がん[13].卵巣がん[14].乳がん[15].結腸がん等多くのヒト腫瘍の研究に広く用いられている[16]。 現在までに.国内外の研究者により.分化型甲状腺がん患者の血清検体を用いたプロテオミクス的アプローチが行われ.いくつかの潜在的な血清タンパク質マーカーのスクリーニングや.DTCの診断に高い特異性と感度を有する血清タンパク質プロファイリングモデルが確立されています。
1.1 マトリクス支援レーザー分解イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF-MS)
MALDI-TOF-MSは.タンパク質の分離・同定のための伝統的な技術です。 窒素を用いたパルスレーザーを用いて.マトリックスにレーザーのエネルギーを吸収させ.ペプチドサンプルをイオン化する方法です。 その後.ペプチドサンプルは質量分析計に入り.質量電荷比の違いによりイオン化が起こり.ペプチドイオンの関連パラメータ（ペプチドマスフィンガープリント.ペプチド配列ラベルまたは部分アミノ酸配列）が測定され.最後に対応するソフトウェアを用いてプロテオームデータベースを検索し.タンパク質の定性または定量分析に利用されます。
Andrew Martorella ら [17] (2007) は.MALDI-TOF-MS 分析を用いて.甲状腺がん 27 例と血清 32 例で有意に異なる 98 種類の血清ペプチドを同定し.血清ペプチドのフィンガープリントを形成し.このモデルは高い統計精度で 2 群間の血清ペプチド差 を識別することができることを示した。 しかし.実験的に発見されたペプチドモデルは.ブラインドによる選択実験が行われておらず.実験結果の確認や実験方法の改良が必要である。 プロテオミクス研究の進展に伴い.表面増強レーザー分解イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS）など.新しいプロテオミクス技術が開発されています。この技術は.MALDI-TOF-MSとは異なり.未処理の生のサンプル（血清.組織.体液など）を直接使用して.タンパク質の大規模.超微量.ハイスループット.全自動スクリーニングを可能にするものです。 また.関連する疾患の診断や研究のために.タンパク質プロファイルのさまざまな組み合わせで使用することができ.現在.基礎および臨床腫瘍学において広く研究されています。
1.2 表面増強レーザー分解イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS)
SELDI-TOF-MSは.タンパク質のフィンガープリントとして知られており.タンパク質マイクロアレイ.飛行時間型質量分析計.解析ソフトウェアの3つの部分から構成されています。 質量電荷比の異なるタンパク質が装置フィールドを飛行する長さに応じて.測定されたタンパク質群のマップ上の位置がピークの形で示され.コンピュータ処理によりプロットされて質量分析マップとなり.試料中の各種タンパク質の分子量と含有量が直接示される。 実験群グループのスペクトルと対照群グループのスペクトルを比較することで.疾患特異的な関連タンパク質を同定し.捕捉することが可能である。
Yuxia Fan et al [1] (2009) は.SELDI-TOF-MSを用いて.PTCと良性甲状腺病変の患者における3つの血清タンパク質ピーク（ハプトグロビンa1鎖（9190 Da）.アポリポプロテインC-I（6631 Da）.アポリポプロテインC-III（6631 Da））の解析とスクリーニングを行いました。 ハプトグロビンa1鎖の高発現とアポリポ蛋白C-Iおよびアポリポ蛋白C-IIIの低発現をPTCの診断モデルとし.診断感度は98％であった。 特異度は97％であった。 Wang ら [18] (2006) と William H ら [19] (2008) は.同じ方法を用いて.差分タンパク質ピークからなる腫瘍診断モデルを確立しました。 SELDI-TOF-MS法は.悪性腫瘍と良性腫瘍.正常血清の間で異なるタンパク質やペプチドを正確に分析・選別し.それらの間の微妙な違いを検出することができ.同時に.血清を容易に.かつ十分な量を採取して保存することができます。 腫瘍の早期診断や腫瘍特異的なマーカーを見つけるために利用することができます。 しかし.この方法はターゲットとなるタンパク質がないこと.測定ワークが大きいこと.実験結果の再現性が低いことなどの問題があり.さらなる検証はこれからです。
まとめると.上記の実験で得られた差分タンパク質は.感度や特異性にばらつきがあり.そのようなデータを臨床応用することはできない。 Alexander [20] (2009)は.20種類の高純度リコンビナントヒト蛋白質を27の液体クロマトグラフィーによるプロテオミクス研究室に送ったが.正しく20種類の蛋白質を報告した研究室はわずか7室であったという。 このような実験結果の再現性は低い。 ターゲットがない血清中のタンパク質の違いを検出する方法は.うまくいかないようです。
2.分化型甲状腺癌におけるタンパク質の糖鎖修飾異常の研究
実際.腫瘍のプロテオミクス研究は.（i）発現プロテオミクスでは.量と質量電荷比の観点から差分タンパク質をスクリーニングし.腫瘍診断モデルを構築することに主眼が置かれている。 機能プロテオミクスは.タンパク質の構造.機能.作用機序のレベルで.腫瘍の発生と発達を研究することに焦点を当てています。 したがって.タンパク質の違いは.存在量の発現の違いだけでなく.リン酸化.グリコシル化.アセチル化など.タンパク質の合成後の修飾の違いによって生じる[21]。 中でも糖鎖修飾はタンパク質の翻訳後修飾の中で最も重要なものの一つであり.科学研究において最も多く研究されている。
タンパク質の糖鎖修飾は.オリゴ糖の断片とアミノ酸の側鎖が共有結合し.さらにアミノ酸が配列したポリペプチド鎖が折り畳まれて.ある空間構造を持ったタンパク質分子を形成することであり.タンパク質の重要な翻訳後修飾の一つである。真核細胞中のタンパク質の2/3が糖鎖修飾されていると言われている。 タンパク質の糖鎖付加には.膜タンパク質.分泌タンパク質.体液中のタンパク質などの細胞外環境に存在するタンパク質によく見られる.アスパラギン（Asn）を含む側鎖にオリゴ糖断片が共有結合するN型糖鎖付加と.セリン（Ser）またはスレオニン（Thr）を含む側鎖にオリゴ糖断片が付加するO型糖鎖付加がある[1]。 22].
タンパク質のグリコシレーションは.細胞の成長.移動.分化.腫瘍の転移など.細胞内の多くの生理的および病理学的事象の制御に関与している。 細胞膜表面糖タンパク質は.細胞の最外層に位置し.内外の環境とコミュニケーションをとり.受容体の活性化やシグナル伝達など.多くの重要な生物学的プロセスに関与している[23]。 真核細胞のタンパク質の2/3はグリコシル化修飾されており.多くの細胞表面受容体はEGFR.インテグリン.TGFBRなどの糖タンパク質に属し.これらは全てN-グリコシル化されている[21]。
Arcinas [24] は.2009年に.5つの異なるヒト甲状腺癌細胞株の細胞表面および分泌タンパク質の発現プロファイルを比較分析し.合計333個のグリコシレーション修飾タンパク質を同定した。 分化した甲状腺癌細胞株（TPC-1.FTC-133）の研究では.細胞膜タンパク質.ボツリン.細胞接着分子-1.栄養膜糖タンパク質.円盤状インテグリンα-5タンパク質鎖の5つのタンパク質がDTCにのみ発現していた。 三好ら [21] （2010）は.分化甲状腺癌グリコシル化修飾腫瘍細胞において.さらに次のことを示した glycosylation-modified transferase FUT8は発現初期に.GnT-Vは発現後期に有意に発現が増加することがわかった。
以上の研究から.甲状腺ヒストン蛋白の糖鎖付加が亢進していることは明らかである。 また.今回の研究では.肝細胞がん（N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV.GnT-V；N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII.GnT-III；α1-6インクホルン糖転移酵素.α1-6FT）[25].乳がん（N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼV .GnT-V）[26].前立腺がん（B結合ビーズ蛋白）[27]患者において.その効果が認められました。 Hidenori [28]は.甲状腺癌患者の血清中にガレクチン-3の発現を検出した。 現在.分化型甲状腺癌の早期診断における血清タンパク質のグリコシル化修飾の研究は比較的まれですが.このアプローチはまだ有望で.いくつかのDTCの糖鎖修飾の異なるタンパク質をスクリーニングし.診断モデルとしてより特異なサイログロブリンと組み合わせるなどの新しい研究アイデアを提供していますので.分化型甲状腺癌の異常なタンパク質グリコシル化修飾の研究にはさらなる研究が必要とされています。
まとめと展望
結論として.分化型甲状腺癌の血清診断の早期研究は.まだ実験段階である。 ターゲットフリー血清プロテオミクス研究は非常に明確な研究アイデアを提供するが.血清プロテオミクスは以下の理由により.これまで分化型甲状腺癌の早期臨床診断に適用されていない。1,上記の血清検査結果を慎重に分析すると.研究機関によって得られる差分タンパク質は大きく異なり.実験データの再現性が低いため.臨床応用は不可能である[20]。2,血清タンパク質の 血清タンパクの99%はアルブミン.トランスフェリン.コンジュゲートグロブリンなど22種類の高分子量タンパク質からなり.残りの1%は数百種類の低分子量タンパク質から構成されています。 血清中のタンパク質の数は多様であり.しばしば動的である[9]。 低分子ペプチドの存在量が少ない非標的の血清/血漿から腫瘍マーカーを見つけようとする現在の伝統的なアプローチはうまくいかないようです。3 変化したタンパク質数の一本調子の研究。 遺伝子の変化による正常組織と腫瘍組織の違いはタンパク質に反映されるが.タンパク質の機能差は発現量の違いだけでなく.リン酸化.グリコシル化.アセチル化など.タンパク質の合成後の修飾の違いによってより生じる。 特に分化型甲状腺癌に特異的な糖鎖修飾タンパク質の研究において.上記のような研究成果を挙げることができる。